01 遇见/摘要
近年来，亚胺还原酶（IRED）因其能够催化还原胺化反应直接合成烷基化手性胺而受到广泛关注。然而，已报导的IRED大多底物谱较窄、催化效率低、且热稳定性差，使得工程化改造成为其工业化应用的必经之路。尽管IRED在药物分子Abrocitinib和GSK2879552的工业级制备中已经展现出巨大的潜力，但大量的突变和筛选工作也成为了扩展其应用范围的阻碍。因此，基于理性设计开发精巧的改造策略显得尤为重要。
氮杂环手性胺是很多药物和农用化学品的关键结构单元，著名糖尿病治疗药物利拉利汀、阿洛列汀，恶行肿瘤治疗药物依布替尼以及银屑病治疗药物托法替尼均含有此类结构单元，因此利用酶法绿色、高效、直接的合成氮杂环手性胺具有广泛的应用前景。近日，高书山/雷晓光/孙周通研究员团队合作，基于亚胺还原酶的晶体结构对亚胺还原酶IR-G36进行设计改造，实现了烷基化氮杂环手性胺的高效合成，为IRED的理性设计和烷基化氮杂环哌啶胺的工业化生产奠定了基础。
02 遇见/内容
作者以N-Boc-3-哌啶酮和苄胺为模式底物，对IRED酶库进行筛选，仅获得了催化效率非常低（Kcat/Km = 0.001 min-1 mM-1），且立体选择性（78%, R）很差野生型蛋白IR-G36。为了对目标酶进行理性设计来提高酶的催化效率，作者首先解析了IR-G36的蛋白质结构。基于对IR-G36结构和多重序列保守性分析，作者利用辅因子氢键网络重构策略，显著提高了催化效率（Kcat/Km = 0.010 min-1 mM-1）和立体选择性（>99%, R）。随后，作者通过活性口袋氨基酸的单点饱和突变获得了18个优势突变，并利用三轮迭代组合突变策略对优势突变进行组合，获得了最优突变体M4。相对于野生型而言，M4的催化效率提高了3349倍（Kcat/Km = 3.350 min-1mM-1），同时大幅提高了底物载量并降低了酶的载量。此外，作者还通过理性设计对酶进行了热稳定性改造，结合蛋白内部氢键网络的重构和“consensus”策略，实现了热稳定性的显著提高（Tm值提高16.2 ℃）。最后，作者结合蛋白结构分析、分子对接和分子动力学模拟，解析了最终突变体催化效率、立体选择性和热稳定性提高的关键因素。
为了扩展亚胺还原酶的应用范围，作者利用突变体M5完成了不同氮杂环酮与多个胺供体的制备级反应，并且展现出优异的催化效率和立体选择性。同时，作者利用M5的实现了模式底物的百克级生物转化，在24.9 g/L底物浓度下，转化率达到97%，时空产率高达35.3 g L-1 d-1。
该成果近期作为“hot paper”发表于Angewandte Chemie International Edition，文章的共同第一作者是中科院微生物所博士后张军博士、江苏省产业技术研究院的廖道红博士以及苏州青云瑞晶生物科技有限公司的陈荣昌博士为本文的共同第一作者，高书山研究员、雷晓光教授以及孙周通研究员为本文的共同通讯作者。冯雁教授与许建和教授对本文的撰写提供了宝贵建议。
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