来源：遇见生物合成
作者：李德海组（中国海洋大学）
遇见-背景
真菌混源杂萜具有复杂的结构特征和广泛的生物活性，为药物开发提供了丰富的先导化合物资源，如免疫抑制剂霉酚酸（mycophenolic acid）、胆固醇酰基转移酶抑制剂pyripyropene A和抗菌药物fumagillin等。混源萜类化合物的生物合成主要涉及类异戊二烯（萜类）与其他途径的结合，其中，异戊烯基转移酶（PTases）通过将萜烯部分装载到非萜受体上，在构建混源萜骨架中发挥了至关重要的作用。UbiA型PTases是一种广泛分布的膜嵌入式异戊烯基转移酶超家族，通常依赖Mg2+催化多种聚异戊烯基链转移到芳香受体上。然而，尽管UbiA型PTases广泛参与多种小分子的生物合成，但其通常将具有严格的底物选择性，特别是对于非萜受体的选择。此前，已从厦门链霉菌中报道了一例PTase，XimB，可以将一种异戊二烯转移到不同的苯甲酸酯底物上，但对非萜受体底物具备宽泛性的UbiA型PTase尚未被报道。图片图片
遇见-内容
在前期工作中，本文研究团队从一株青霉Penicillium funiculosum GWT2-24中分离得到了4个chrodrimanin类混源萜化合物，包括两个典型结构chrodrimanins A和B，以及两个非典型结构I和J(1和2)。其中，1和2是首次被报道的由苯并环己酮衍生物与倍半萜加和而成的(6/6/6/6/6)五环骨架混源萜（图1A）。Chrodrimanins A和B的生物合成已经被证实来源于聚酮前体6- hydroxymellein （3）的法尼基化，而1和2的起源尚未得到阐明。近日，本文团队对1和2的生物合成进行研究，揭示了1和2骨架的独特性来源于一个具备广泛底物选择性的PTase， CdnC，其可以识别另一条独立基因簇产生的聚酮前体并对其进行法尼基化修饰，进而经过与chrodrimanins A相同的后修饰过程生成1和2。值得注意的是，CdnC的底物被证实不限于天然的苯并环己酮前体，还包括多种羰基苯的衍生物。
图 1. 具备底物宽泛性的UbiA型PTase CdnC通过将基因簇PKS47和cdn协同作用在1和2的生合成中起到关键作用。
基于聚酮衍生混源萜的生合成逻辑，本团队对基因组中的UbiA型PTase进行了挖掘。其中含有CdnC的基因簇cdn与chrodrimanins A的生合成基因簇高度相似，因此簇cdn被选定为研究对象。为了确认1和2是否来自簇cdn，将整个cdn簇在工程宿主构巢曲霉 A1145中进行异源表达（AN-CdnABCDEFGJ）。但LC -MS分析表明，异源株只得到了一系列苯并吡喃酮衍生的典型chrodrimanins类化合物，而苯并环己酮类的chrodrimanins则未被检测到。为了确定是否存在簇外的内源酶催化吡喃酮型chrodrimanins转化为环己酮型chrodrimanins（图1B（i）），对菌株AN-CdnABCDEFGJ进行13C同位素标记下的放大发酵，并分离纯化出13C标记的chrodrimanin C。将粗提物和13C标记的chrodrimanin C分别喂养给野生型GWT2-24，LC-MS分析未检测到13C标记的环己酮类chrodrimanins，说明1和2不太可能从吡喃酮类结构转化而来。因此，它们最初可能来自苯并环己酮前体的FPP化，推测其法尼基受体可能是黑色素生物合成途径（DHN-melanin, DM）的产物scytalone（precursor 5）（图1B（ii））。
DM途径是一种在丝状真菌中广泛存在的聚酮途径，可以产生多种包括5在内的羟基萘（苯并环己酮）衍生物。在GWT2-24中定位DM基因簇PKS47后（图1 c），将其中的3个基因（NR-PKS母核，庚烯酮水解酶，四羟基萘还原酶）和cdn簇中的基因（假定的法尼基环氧化酶，萜环化酶和短链脱氢酶等负责萜烯部分后修饰的酶）在A1145中共表达（AN-PKS47GED-CdnCBD和AN-PKS47GED-CdnCBDEGJ），异源株成功产生了1-2，6-9，以及四个衍生自化合物14的新混源萜10-13（图2A）。这些结果表明，1和2的生物合成依赖于提供聚酮前体的基因簇PKS47和将其整合到混源萜组装线上的基因簇cdn的协同作用，其中UbiA型PTase CdnC可能在多种苯并环己酮前体的利用中发挥重要作用。
随后，将PKS47GEDC在A1145表达得到了1和2的前体5，在酿酒酵母BJ5464-NpgA中表达CdnC并与5进行了体外实验，LC-MS检测到目标产物6（图2B（i））。通过将PKS47GED和cdnC在A1145中共表达，上述结果进一步在体内实验中得到验证(图2B（ii）)。
图 2.根据化合物1和2的结构相似性和相关基因簇，提出了1和2可能的生合成途径。
为了测试后修饰酶的功能，在酿酒酵母中过表达cdnB，cdnD, cdnE, cdnJ 用于体外催化实验。将6和10与CdnB反应，成功生成了产物7和11（图3A(i)）；将CdnB和CdnD与6和10共孵育，得到与1和2相同环系的主要化合物9和13（图3A(ii)），以及两个微量产物8和12。此外还观察到，在酸性条件下，化合物7可以非酶转化为8和9，而CdnD可以促进环化过程。然后，化合物9和13分别被CdnE完全转化为1和19 (图3A(iii))。有趣的是，1可以被CdnJ进一步转化为2，然而19却不能被CdnJ转化（图3B）。上述结果表明，CdnB、CdnD和CdnE对FPP化的苯并环己酮中间体也具有宽泛性，而CdnJ可能不具有宽泛性。
为了进一步探索CdnC的宽泛性和特异性，对PKS47基因簇的异源株进行了放大发酵，得到了另外两个苯并环己酮结构15和16。化合物15和16与chrodrimanins A和B的天然前体苯并吡喃酮3被一起用于检测CdnC的体外底物选择性（图3C）。最后， 3和15转化得到FPP化产物4和17。
图 3. 1和2完整生物合成途径的构建和CdnC的底物选择性研究。
为了更深入了聚酮前体对CdnC选择性的影响，CdnC被同源建模并与苯并吡喃酮类前体3和苯并环己酮前体（5、14和15）进行了分子对接。对接结果显示，不同底物在催化口袋内具有相似的取向，在Asn87的氢键作用力下，聚酮前体的C5位被暴露于FPP结构的C1’位，形成了相对催化中心较近的距离，这解释了CdnC对聚酮前体C5位的选择性偏好。16不能被识别的原因被解释为芳环上的优势取代位置的转换。对Asn87的点突变分析表明，CdnCN87A和CdnCN87G对3，5，14和15的催化能力完全丧失，这证实了Asn87是CdnC催化活性的关键位点。
为了确定苯羟基的给电子效应是否是FPP化反应的唯一决定因素，我们测试了CdnC对25种具有不同环系和苯取代基团底物的催化活性。结果表明，三种羟基苯甲醛化合物（PK1-3）和一种羟基苯甲酸化合物（PK4）可以被CdnC催化生成FPP化产物(图4A)，说明FPP化过程可能受到供电子效应和酶与底物之间诱导拟合的双重影响。此外，还通过系统进化树、序列相似网络(SSN)和基因簇定向检索对CdnC进行了进化分析(图4B)。
图 4. CdnC的底物拓展及其进化分析。
总之，本研究首次阐释了chrodrimanins I和J的生物合成途径，证明含苯并环己酮的新颖混源萜骨架的构建得益于一个具备多底物选择性UbiA型 PTase CdnC对DHN melanin途径中间体的法尼基化和之后的一系列的氧化还原反应。CdnC是第一例在真菌中报道的可以识别单环和双环聚酮底物的UbiA型PTase，并基于CdnC的功能，获得了一系列新的混源萜类化合物，极大地扩展了chrodrimanins结构的多样性，为chrodrimanin的生产提供了一个高效的生物合成平台，并为FPP来源混源萜类化合物的组合生物合成提供了参考。
本文的通讯作者为中国海洋大学医药学院李德海教授，张开金博士和张国建副教授为共同第一作者。李德海教授现任医药学院副院长，其课题组主要从事海洋天然药物化学研究，主要包括深远海、共附生等特殊海洋环境来源微生物功能基因和代谢产物的挖掘利用；活性次级代谢产物发现、结构优化及构效关系研究；真菌代谢产物的合成生物学研究。