来源：遇见生物合成
作者：侯雪丽
01 遇见/背景
Blasticidin S (BLS) 是1958年首次在Streptomyces griseochromogenes的代谢产物中分离的一种肽核苷类抗生素，通过碱基配对的方式结合到核糖体50S大亚基的P位点上，从而抑制肽键的形成，对水稻稻瘟病有高效的防治作用[1]。2003年T. Mark Zabriskie课题组报道BLS生物合成基因簇中含19个开放阅读框，并对部分基因进行体外表征[2]。2013年上海交通大学邓子新院士团队通过四次同源重组成功实现了BLS的异源表达[3]。当把blsE的基因敲除，会积累CGA，证明CGA是BlsE的反应底物，发现BlsE催化CGA中C5′脱羧生成CAP[4]。2017年复旦大学张琪教授团队采用同位素标记底物的方法发现BlsE是一种新型的非氧化的自由基SAM脱羧酶[5]。近日，德克萨斯大学、中科院上海有机化学研究所/中科院深圳先进研究院、西北农林科技大学和厦门大学的学者，在《J Am Chem Soc》合作发表论文“Radical S‑Adenosyl Methionine Enzyme BlsE Catalyzes a Radical Mediated 1,2-Diol Dehydration during the Biosynthesis of Blasticidin S”，结合化学生物学、结构生物学和理论计算的方法，发现BlsE并不是催化自由基介导的非氧化脱羧，而是催化CGA (8) 发生1,2-二醇脱水反应，随后发生非酶促的脱羧反应（图1）[6]。
图1 BlsE的催化机理简图
02 遇见/内容
为了研究BlsE的催化机制，研究者首先对BlsE与CGA (8) 的反应体系进行HPLC分析，反应1 h后，CGA (8)和SAM (13) 几乎完全消耗，有a、b、c三个产物 (图2)。分别鉴定a是5'-脱氧腺苷 (15)；b为pentopyranone (PPN, 19)，包含keto (19a) 和gem-diol (19b) 两种构型。c在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定生成b，确定c为PPN的亚硫酸盐化合物 (21)。研究者推测CGA (8) 到PPN (19)需要两步反应，BlsE催化8发生脱水反应生成4′-keto中间体18，随后发生非酶促的脱羧反应（18→19）。为了验证这个推测，研究者加大反应体系中BlsE的浓度同时缩短反应的时间，希望捕捉到脱羧前的产物18。HPLC分析如图2D所示，在反应5min时，有新的产物d出现，反应10 min时，d峰的信号减弱，用NaBH4还原后出现d'峰，NMR和MS鉴定d'为cytosine 3'-deoxyglucuronic acid (22)，结果表明d为β-keto acid 18。因此，BlsE不催化CGA (8) 的脱羧反应，而是作为1,2-二醇脱水酶催化8生成18。
图2 通过HPLC分析BlsE与CGA的反应
其次研究者对BlsE的脱水机制进行深入探究，推测其脱水反应机制与apramycin和D-desosamine生物合成途径中的自由基SAM裂解酶AprD4和DesII的催化机制相似。如图3A所示推测的催化机理图，生成的底物自由基（23）可以通过以下两种机制完成脱水：一种是3'-羟基向C4'的1,2-迁移产生4'-gem-二醇自由基中间体（23→24），随后一个电子的还原脱水得到18（机制a）；另一种是通过C4'-α-羟烷基去质子化形成4'-碳负离子(23→25/26)，再进行3'-OH消除(26→27) (机制b)。另外还有一种机制b的变形机制c，发生直接的消除反应(23→27)。为了验证这些假设，研究者利用同位素标记底物(4'D-8、[4'-18O]-8、[3'-18O]-8)、含氟底物类似物(4'DF-8和3'F-8) 以及C5'羧基被取代的类似物 (28和29) 的方法进一步研究BlsE催化反应的中间步骤，证实BlsE催化通过CGA C4' α-羟烷基自由基直接消除水而不是C3'-羟基的1,2-迁移发生的脱水反应。
图3 A BlsE催化的脱水反应机理, B CGA的底物类似物
为了揭示BlsE催化的蛋白结构基础，研究者分别解析了BlsE•SAM和BlsE•SAM•CGA的晶体结构 (图4A)，确定底物CGA与BlsE作用的关键残基（图4B），发现组氨酸H279可以锁定底物CGA的胞嘧啶部分，形成π-π堆积。底物的结合会使得E281偏移8.0 Å，并与E196形成氢键作用，使得活性口袋呈闭合的状态（图4D）。Y263F、Y263E、T72S和T72V突变体测活实验证明C5'的羧基对底物识别的重要性。同时发现，活性位点残基中并不包含明显的碱性残基，因此推测机制b中的碳负离子是通过4'-OH与3'-OH之间的分子内的质子转移而非碱性蛋白残基对4'-OH的去质子化而形成 (机制c)。BlsE是自由基SAM酶超家族中首个被表征的twitch家族裂合酶。
图4 三元复合物BlsE•SAM•CGA的结构
为了评估BlsE的脱水反应机制，研究者基于复合物的晶体结构进行了分子动力学(MD)模拟和量子力学/分子力学(QM/MM)计算。QM/MM优化的α-羟烷基自由基中间体23中，C4'-OH上的H与C3'-OH形成稳定的分子内氢键(图5)，这有利于分子内的质子转移。理论计算结果显示，分子内质子转移脱水(23→27)的能垒为18.4 kcal/mol，反应速率常数约为12 min-1，这一数值与先前实验上报道的（1.6 min-1）接近。并且，在得到的中间体IC3中，水分子位于烯醇自由基27的附近，推测可能在后续的烯醇自由基还原生成酮18中起作用。
综上所述，研究者发现BlsE催化底物CGA的1,2-二醇脱水反应，修正了之前人们对BlsE功能的认知。结合化学生物学、结构生物学和理论计算的方法系统地揭示了BlsE催化反应的分子机制。该研究表明BlsE催化CGA发生脱水反应是通过分子内的质子传递产生4'-碳负离子进而脱去3'-OH完成的，而由于生成的β-keto acid (18) 产物的不稳定性，该产物容易进一步发生非酶促催化的脱羧反应，这一发现解释了早期文献报道中观察到脱羧反应的原因。虽然BlsE催化CGA生成的β-keto acid (18) 并不稳定，但此中间体可能在生物体内有效地被下游的生物合成酶所利用，从而完成BLS的生物合成，该推测的验证还有待开展进一步的深入研究。
图5 QM(UBP86/B2)/ mm计算能量剖面和优化自由基介导的C3 '羟基直接消除脱水反应的结构(23-27)
值得一提的是，复旦大学张琪教授课题组近期在Chemical Communications上发表的工作“Glucuronyl C4'dehydrogenation by the radical SAM enzyme BlsE involved in blasticidin S biosynthesis”(https://doi.org/10.1039/D1CC06942J)（详见往期推荐1）。他们合成了CGA的氨基类似物CGM，发现BlsE可以催化CGM发生脱氢反应生成CkGM，证明了BlsE的催化多样性。同时证实氨基转移酶BlsH以L-天冬氨酸为氨基供体，催化CkGM生成CaMG，负责BLS C4'位氨基的生成。这与JACS文章结论中的推测是吻合的。
该研究工作得到了基金委面上项目基金和国家重点研发计划“合成生物学”重点专项基金的支持。晶体衍射数据是在上海光源BL19U1光束线站上收集。美国德克萨斯大学奥斯汀分校博士生李渝萱、访问学者陈日道博士、西北农林科技大学&上海有机所联合培养博士生候雪丽为共同第一作者。西北农林科技大学高锦明教授、厦门大学王斌举教授、中科院深圳先进研究院周佳海研究员及德克萨斯大学奥斯汀分校刘鸿文教授为论文的共同通讯作者。
参考文献
[1] Takeuchi, S.; Hirayama, K.; Ueda, K.; Sakai, H.; Yonehara, H. Blasticidin A: a new antibiotic. J. Antibiot. 1958, 11, 1-5.
[2] Cone, M. C.; Yin, X.; Grochowski, L. L.; Parker, M. R.; Zabriskie, T. M. The blasticidin S biosynthesis gene cluster from Streptomyces griseochromogenes: sequence analysis, organization, and initial characterization. Chembiochem 2003, 4, 821-828.
[3] Li, L.; Wu, J.; Deng, Z.; Zabriskie, T. M.; He, X. Streptomyces lividans blasticidin S deaminase and its application in engineering a blasticidin S-producing strain for ease of genetic manipulation. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79, 2349-2357.
[4] Feng, J.; Wu, J.; Dai, N.; Lin, S.; Xu, H. H.; Deng, Z.; He, X. Discovery and characterization of BlsE, a radical S-adenosyl-lmethionine decarboxylase involved in the blasticidin S biosynthetic pathway. PloS one 2013, 8, e68545.
[5] Liu, L.; Ji, X.; Li, Y.; Ji, W.; Mo, T.; Ding, W.; Zhang, Q. A mechanistic study of the non-oxidative decarboxylation catalyzed by the radical S-adenosyl-l-methionine enzyme BlsE involved in blasticidin S biosynthesis. Chem. Commun. (Camb). 2017, 53, 8952-8955.
[6] Lee, Y.-H.; Hou, X.; Chen, R.; Feng, J.; Liu, X.; Ruszczycky, M. W.; Gao, J.-M.; Wang, B.; Zhou, J.; Liu, H.-w. Radical S‑Adenosyl Methionine Enzyme BlsE Catalyzes a Radical Mediated 1,2-Diol Dehydration during the Biosynthesis of Blasticidin S. J Am Chem Soc 2022. DOI: 10.1021/jacs.1c12010