撰文︱刘心朗
责编︱王思珍
海马体的记忆和导航功能，传统上是在特征选择性层面上进行研究的，即单个位置细胞或神经回路水平进行表征（如认知地图），而在这些不同级别的选择性层面中存在着一定的脱节[1-3]。由少量兴奋性主细胞和抑制性中间神经元产生的中尺度回路基序被认为是连接单细胞活动和宏观认知功能之间的桥梁[4,5]。目前，研究已经证明了单细胞活动会引起回路动力学和最终行为的改变[6]，因此，单个神经元是如何参与到多细胞系中以执行特定功能就显得尤为重要[7]。
在海马体中，对于已经鉴定的局部回路的功能组织在很大程度上尚未被探索。传统观点认为，在海马CA1区，空间调谐（spatial tuning）会根据锥体细胞的前馈输入而出现在锥体细胞的一个亚群中。因此，CA1是否也可以通过局部计算灵活地调节空间选择性，仍然未知。而解决这一问题的根源在于：如何获取体内突触耦合微回路、以及如何将光遗传操作精确应用到单个神经元，甚至是精准应用到锥体细胞层的致密结构中。
2021年12月，美国纽约哥伦比亚大学神经科学系的Tristan Geiller（第一作者并通讯作者）、Attila Losonczy（通讯作者）等人在Nature上发表了题为“Local circuit amplification of spatial selectivity in the hippocampus”的研究论文。作者开发了一种用于单突触逆行追踪的体内电穿孔方法和精确到单细胞操作的光遗传学方法，继而揭示了单个CA1神经元的空间选择性通过局部回路的可塑性被放大，从而使有效的多神经元表征能够在不降低前馈输入结构的情况下灵活地度量局部环境特征。
研究人员首先应用单细胞电穿孔的方法，将重组狂犬病毒（RABV-TVA）受体、糖蛋白（G）和荧光蛋白（Venus）三种质粒共表达在小鼠背侧海马[8,9]，进行神经元基因标记，并对单个CA1起始锥体细胞进行单突触狂犬病毒（RABV）追踪[10]。电穿孔2天后，在起始细胞附近注射包裹EnvA的糖蛋白缺失tdTomato-RABV14。10-14天后，在整个海马体中均可观察到tdTomato的突触前神经元（图1 a-e）。同时发现，起始锥体细胞的局部输入为抑制性中间神经元。由于在这一位置存在大量的局部抑制性连接，那么起始锥体神经元的空间调节是否会随着其突触前神经元的抑制水平而改变呢？
接下来，为了寻找单个位置细胞与局部突触前成分的功能耦合，研究者使用VGAT-Cre系统在所有抑制性中间神经元中表达了钙指示剂GcaMP7。训练小鼠在跑步机上跑步，在对起始细胞和局部中间神经元进行双光子成像后注射tdTomato-RABV14，在14-21天后，记录了19个起始锥体细胞以及它们各自的突触前中间神经元（图 1f-j）。
图1 海马CA1区体内单细胞电穿孔和单突触狂犬病追踪
（图源：Geiller T, et al., Nature, 2022）
研究人员在11个位置野的自发形成（瞬间出现的大幅度Ca2+瞬变和紧随其后的一系列重复活动）中记录了突触前神经元、锥体起始细胞和未标记的中间神经元细胞在位置野形成前、形成期间和形成后的神经元活动水平，观察到第一个神经元活动的出现与突触前中间神经元活动水平的变化不一致（图2 b-e）。为了分析突触前中间神经元在位置野形成过程中的空间选择性，使用位置野内选择性（IFS）指数来衡量给定的中间神经元在起始位置野内是否比在位置野外更活跃（IFS更接近1）或更不活跃（IFS接近-1）。作者使用该指数，评估了位置野形成前、中、后周围活动的变化，均未发现中间神经元空间选择性的显著性改变（图2 f, g）。这些结果表明：突触前抑制在其目标锥体细胞中形成位置野期间和之后立即保持相对恒定，在该过程中中间神经元并未发挥主要作用（图2）。
图2 自发性位置野的形成与突触前抑制水平的明显下降无关
（图源：Geiller T, et al., Nature, 2022）
接下来作者研究了当起始锥体细胞已经建立位置野时候的中间神经元的空间活动是否不同。发现中间神经元的活性较高，而突触前中间神经元在穿越位置野时的活性低于未标记的中间神经元（图3 a, b）。而这两种细胞之间的活动性差异仅在位置野峰值附近才有显著差异（图3 c, d）。在穿越稳定的空间感受野时，突触前抑制较低，而在新形成的感受野突触前抑制则不低。因此，作者得出结论：位置细胞空间感受野的出现触发了CA1局部回路中的可塑性重组，最终导致它们自己的突触前抑制出现负选择性。
图3 位置细胞的突触前中间神经元表现出逆向空间选择性
（图源：Geiller T, et al., Nature, 2022）
局部回路的可塑性可以促进导航过程中单细胞表征和神经元间选择性之间的相关动力学，然而，位置细胞是否可以单独引起这种特定位置的重组，仍然未知。为了验证这个问题，研究人员开发了一种光遗传学方法，通过在预定位置诱导位置野形成，然后纵向追踪其动力学重组情况。首先电穿孔单个锥体细胞并标记，为了在后期能够形成持续的位置野，在任意位置进行光刺激（图4 b），并在VGAT-Cre小鼠中监测位置细胞如何控制在此位置对中间神经间的动力学进行重新配置的（图4 c）。研究结果显示：当光刺激电穿孔的锥体细胞后中间神经元活性增强（图4 d）。当成功诱导位置野出现时，为了能够在刺激后阶段对该位置进行反向调谐，中间神经元的一个子网络会对他们的空间反应进行重新分配（图4 e,f）。在对每个细胞的反选择性的程度进行量化后发现，在任意位置过程中诱导位置野活动性的增加与中间神经元在刺激后阶段中的反选择性强度相关（图4 h）。而当诱导位置野失败时，这种重组模式不存在。同样，诱导位置在诱导发生前并没有偏向高数量的负选择性中间神经元。这些结果表明：单个CA1锥体细胞中位置野结构可以促进局部回路中的可塑性重组。
图4 单个锥体细胞的光遗传位置野诱导可重组神经元间网络
（图源：Geiller T, et al., Nature, 2022）
进一步了解单个锥体细胞对局部回路的影响程度发现，对电穿孔的单个锥体细胞的光刺激增加了其他局部锥体细胞中Ca2+活动，这在任何电穿孔出现之前都没有见过，表明光刺激不能单独解释这种效应（图5 c）。对光刺激反应增强的锥体细胞（称为募集的神经元）更有可能在刺激后阶段进行空间调整（图5 e）。值得注意的是，这种量化仅限于在任意位置刺激过程中尚未被调整的募集神经元，而这种效应只有在诱导成功时才会看到（图5 e）。此外，在刺激后阶段，相比较于电穿孔的单个锥体细胞的电场密度（位置），新位置细胞的在该位置的电场分布更密集（图5 f）。这些结果表明：在单个电穿孔单个锥体细胞中位置野的成功激活能够招募锥体细胞亚群，这些锥体细胞将在该位置进行空间调谐。因此，在此结构基础上，CA1回路才可以将源自单个神经元的空间表征传播到多细胞亚群，而不会在群体水平上对整体的空间表征产生影响。
图5 在位置野诱导过程中，局部锥体细胞的募集与子网络结构相一致
（图源：Geiller T, et al., Nature, 2022）
接下来，为了进一步探究该结构和可塑性所扮演的角色，研究人员建立了一个海马体CA1区域的计算模型。首先，单细胞相互作用中无法观察到上述的动力学改变，例如，单一的锥体神经元不足以刺激中间神经元活动的。然后，通过子网结构引入了某种程度的连接特异性，电穿孔的单个锥体细胞中位置野的出现增加了其突触后相邻锥体细胞在子网结构内的反应。当在锥体细胞与中间神经元突触之间引起短期突触抑制时，特定子网内的中间神经元在目标位置的特定兴奋性输入被抑制，因此，在最初形成位置野的位置选择性地降低了它们的活动。最后，抑制水平的降低反过来促进了该位置被子网的其他锥体细胞放大。
文章结论与讨论，启发与展望
首先，该研究开发了一种新的单突触逆行追踪的体内电穿孔方法和一种能够精确操作到单个细胞的光遗传学方法。研究也发现了海马CA1区单个位置细胞的空间调谐会传递到其所属的功能递归子网络，同时，单个神经元位置野的出现会引起突触前中间神经元的一个亚群反向选择性发展，并在该位置招募功能耦合的位置细胞。证明了单个CA1神经元的空间选择性能够通过局部回路的可塑性被放大，而这种局部放大可以灵活且有效地编码CA1区与行为相关的空间表征，提示CA1锥体细胞在功能上的耦合性比我们以前认为的更强，而这些连接可能是通过单突触、多突触或通过缝隙连接的[11-13]。中间神经元兴奋性输入和抑制性输出的短期突触可塑性也有助于描述局部回路重组[14]。因此研究人员推测，可以通过优化这种子网络结构，以使CA1能够通过局部回路放大作用将行为显著性地分配给CA3表征，从而使多神经元表征能够在不降低前馈输入的情况下灵活地放大局部环境特征，而不影响总体存储容量或特异性。
目前尚不清楚其初始结构基础及控制其传播的精确解剖结构和精细规模的子网络连接。它们可能在发育过程中产生，也可能来自于依赖经验的结构可塑性。此外，局部回路重组的逐渐形成表明，个体或少数电穿孔单个神经元中的初始、快速位置野形成事件随后可以通过较慢和更分级的可塑性机制通过其相关子网络进行传播。而神经可塑性的精确位点和分子机制是否是特征选择性局部回路放大的基础，仍需进一步研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-04169-9