用于联芳键形成的生物催化氧化交叉偶联反应！
联芳基化合物具有两个相连的芳环，广泛存在于医学、材料科学和不对称催化反应中。最常用的构建这些分子的策略依赖于预官能化芳基片段的金属催化交叉耦合，尽管代价是在合成过程中增加额外的步骤，但提供了预编程的位点选择性。这些反应可能需要进行广泛的筛选，以确定每一对新的耦合对的合适条件，并且仍然局限于容易接近的连接性，而四邻位取代的联芳基键的形成仍然是一个突出的挑战。氧化偶联为双芳基键的形成提供了另一种策略，通过将两个C-H键转化为C-C 键。然而，这些优点是以转化的效率和选择性为代价的，而这种转化通常取决于每种基底的内在空间和电子性质，从而限制了这种转化的多功能性。
许多金属催化剂和无金属氧化剂已被报道用于酚醛底物的二聚和交叉偶联。然而，这些方法的应用通常仅限于富电子酚类，而与缺电子酚类的氧化偶联仍然具有更广泛的挑战性。生物催化氧化交叉偶联反应有可能通过提供具有催化剂控制选择性的范例来克服小分子介导的直接氧化偶联方法固有的局限性。
鉴于此，美国密歇根大学的Alison R. H. Narayan教授课题组报道了一种使用细胞色素P450酶通过氧化C-C键形成进行生物催化交叉偶联的策略，展示了使用天然P450催化剂在一组酚醛底物上催化交叉偶联反应的能力。此外，研究人员设计了一个P450，通过将低产率、非选择性反应转化为高效和选择性的过程，使其具有所需的反应性、位点选择性和对映选择性。这种构建空间位阻联芳键的简化方法为组装具有催化剂控制的反应性和选择性的分子提供了一个可编程平台。相关研究成果以题为“Biocatalytic oxidative cross-coupling reactions for biaryl bond formation”发表在最新一期《Nature》封面。
相关进展：
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【实验设计】
自然界已经进化出氧化酶，包括漆酶和细胞色素P450(P450s)，它们在联芳基天然产物的生物合成中介导酚类化合物的二聚化。漆酶在选择性催化中的应用受到这些酶发挥作用的实例的稀缺性的限制控制初始氧化后键形成的选择性。相比之下，不断扩大的P450库介导高选择性氧化反应，其中存在一小部分催化位点选择性和抗阻选择性二聚化的酶（图1）。作者认为这类酶可以开发成可调节的生物催化剂，用于聚合氧化交叉偶联反应，具有催化剂控制的反应性、位点选择性和对映选择性。
图 1. 通过直接氧化交叉偶联形成联芳基键
【反应范围】
有了优化的生物催化平台，作者试图超越自然二聚反应，转向非自然的交叉偶联化学（图2a）。作者认为酶活性位点中两种非等价酚类底物的结合将克服小分子介导的氧化交叉偶联反应中传统的空间和电子限制。在概念验证实验中，香豆素4和16都被添加到产生KtnC的培养物中，导致形成非自然的交叉偶联产物。进一步的实验表明，调整交叉偶联对的化学计量可以使交叉偶联产物形成超过二聚化。使用这种KtnC催化的交叉偶联反应策略，用一组香豆素底物观察到底物混杂（图2b）。4和9–12之间的初始交叉偶联反应表明，在C4和C5位置保持与4相似的取代模式是有益的，但不是活性所必需的。此外，KtnC耐受一系列带有富电子和缺电子取代基的香豆素(13–16)，与通常控制小分子催化的氧化交叉偶联反应的空间和电子限制不同，在香豆素17–22的C4和C5位置添加空间体积也很容易被接受。除了形成一系列不对称双香豆素产品外，还测试了一组更多样化的酚醛底物作为香豆素4的交叉偶联对（图2d）。一般而言，观察到与天然底物4相似的酚类底物具有优异的反应性；然而，随着底物结构与天然香豆素支架进一步分离，交叉偶联活性和位点选择性显着降低。
图 2. 野生型 P450 KtnC 催化的氧化交叉偶联反应范围
【工程应用】
作者预计成功设计的交叉偶联催化剂 (LxC)可以将低产率、非选择性的生物催化反应转化为实用的合成方法。由于野生型KtnC显示出低水平的反应性和位点选择性（四种交叉偶联产物的总产率<3%），香豆素10和2-萘酚(31)之间的交叉偶联被选为目标反应。作者在高通量酵母生物转化中筛选变体，并通过 Rapid Fire 质谱 (MS) 分析总交叉偶联产物的形成，然后使用液相色谱-MS（LC-MS；图3b）在二级筛选中分析含有较高水平交叉偶联产物的反应混合物的交叉偶联位点选择性。最终，这种两层 MS 筛选能够快速识别变体，提高靶向交叉偶联反应的活性和位点选择性。通过迭代的定向进化，在所需的交叉偶联反应中的总活性和位点选择性逐渐提高（图3c）。作者通过五轮进化设计了一种活性提高了92倍的生物催化剂，但由于对变体进行了工程改造，选择了增加的交叉偶联产率和位点选择性，而反应的对映选择性降低了。为了恢复催化剂对对映选择性的控制，使用 Rapid Fire 和手性 LC-MS 的组合进行了另外两轮工程（图3d）。
图 3. 工程 P450 生物催化剂以提高活性和选择性
【互补反应性】
作者认为，在使用蛋白质工程策略的同时，替代的野生型酶可以为氧化交叉偶联反应提供互补催化剂。作者采用了生物信息学指导的方法，通过利用 SSN 作为工具，来可视化已知介导分子间氧化二聚化反应的 P450 周围的自然序列空间（图4a）。作者在使用 P450-RhFRed 文库进行的一系列大肠杆菌裂解物筛选中，发现交叉偶联产物以 1:1 的比例通过多种酚类底物与萘酚配对物形成，具有令人惊讶的混杂性（图 4b）。这些结果证明了不同 P450 催化剂可实现的互补反应性，并提供了对不同联芳基支架的生物催化途径。
图 4. 探索具有互补反应性的催化剂的替代序列空间
【总结】
本文所提出的生物催化方法通过超越空间和电子限制并重新定义可以有效交叉偶联的底物，克服了反应性障碍。此外，使用大分子配体提供了在联芳基偶联反应中实现催化剂控制的位点选择性和对映选择性的机会。大量可用的天然催化剂，以及已证明的根据所需底物范围、反应性和选择性调整酶的能力，使这种生物催化方法成为联芳基分子聚合组装的有力工具。