Brugada综合征（BrS）是一种罕见性的心脏离子通道病，临床上以右胸导联（V1-V3）ST段呈下斜型或马鞍型抬高、心脏结构无明显异常、恶性心律失常和晕厥反复发作、心源性猝死（SCD）为特征。该病引起的猝死占所有猝死病例的4%，占无器质性心脏疾病猝死者的20%。更为严重的是，大多数患者发生的第一症状就是猝死，根本来不及防范和救治。植入埋藏式自动心脏复律除颤器（ICD）是惟一可预防BrS患者SCD的手段。BrS为常染色体显性遗传病，目前已发现多个致病基因，但其致病机制并不清楚。
2022年2月21日，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属第一医院梁平教授团队在Clinical and Translational Medicine杂志在线发表Hyperactivation of platelet-derived growth factor signaling contributes to arrhythmogenesis in Brugada syndrome的研究论文。该研究发现了TRPM4相关Brugada综合征（TRPM4-related BrS）的新机制以及潜在治疗靶点。
研究团队招募了一名21岁的男性BrS患者，该患者超声心动图未见异常，但心电图表现为特征性BrS波，V2导联ST段呈马鞍型抬高。基因检测发现该患者携带离子通道基因TRPM4的错义突变（c.785C>T; p.T262M），该突变位于TRPM4通道N端，在哺乳动物中高度保守。该突变的变异评级为临床意义未明（variant of uncertain significance, VUS）。
图1. BrS患者临床特征
研究者对BrS患者以及同时招募的一21岁健康受试者（正常人对照）皮肤活检后进行皮肤成纤维细胞的分离、培养和扩增，随后应用非整合型仙台病毒进行体细胞重编程建立诱导多能干细胞（iPSC），并应用心肌定向分化技术获得正常人和BrS患者特异的iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。单细胞膜片钳记录显示正常人组iPSC-CMs中呈现均匀、节律性的动作电位；然而，在很大比例的患者组iPSC-CMs中出现了心律失常表型，具体表现为两种形式：一种是较为常见的延迟后除极（DAD），另一种是相对罕见但更为严重的阵发性细胞颤动（PCF）。此外，研究者在患者组iPSC-CMs中观察到了心律不齐以及动作电位时程（APD）显著缩短。为了获得更为严格的对照进行更加精确的功能学比较，研究者应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行了T262M突变的定点矫正，成功获得了等基因型（isogenic）的基因矫正组（gene-corrected, GC）iPSC细胞株。随即分化的矫正组iPSC-CMs恢复了正常的动作电位特征，与对照组心肌细胞相似。此外，研究者还应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行了正常人iPSC的TRPM4基因敲除（KO），结果显示敲除组iPSC-CMs重现了心律失常表型和异常的动作电位特征，与BrS患者组心肌细胞相似。以上结果提示了T262M是导致心律失常表型的致病突变。
图2. TRPM4 T262M导致BrS患者iPSC-CMs心律失常表型
接下来，研究者对受累基因TRPM4进行了系统性的功能研究。在HEK293T细胞中分别过表达野生型（WT）和T262M突变型TRPM4通道，并通过全细胞（whole-cell）膜片钳和生物素标记的膜蛋白表达实验发现：T262M组TRPM4电流密度显著减小，TRPM4总蛋白和膜蛋白均显著减低，但膜蛋白与总蛋白的比例（膜蛋白/总蛋白）保持不变。在iPSC-CM模型中进行内源性TRPM4通道的蛋白表达检测发现：患者组心肌细胞的TRPM4蛋白表达显著低于正常人组和矫正组心肌细胞，而敲除组心肌细胞中几乎没有TRPM4通道表达。此外，研究者应用内膜向外式（inside-out）膜片钳记录发现了T262M引起TRPM4通道对钙离子的敏感性显著减低。以上结果提示了T262M突变导致了TRPM4通道的功能受损。
图3. T262M导致TRPM4通道功能受损
钙信号异常是心律失常发生的常见诱因，而钙信号在BrS致心律失常机制中的作用越来越受到关注。研究者应用比率钙成像技术检测iPSC-CMs中的钙瞬变发现，患者组iPSC-CMs中出现了心律失常样的钙瞬变特征和钙超载表型，而这一变化并没有在矫正组iPSC-CMs中观察到。有趣的是，患者组iPSC-CMs中L型钙通道电流密度显著增大，而给予L型钙通道阻断剂维拉帕米治疗（100 nM，20天）能够有效逆转患者组iPSC-CMs中的心律失常和钙超载表型。
为了探究TRPM4T262M引起心律失常的分子机制，研究者进行了正常人组、敲除组、矫正组和BrS患者组iPSC-CMs的转录组测序。GO分析显示差异表达基因在离子通道、钙信号、心脏动作电位和传导、以及血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）信号等词条中富集。有趣的是，研究者发现血小板源性生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor B, PDGFRB）在敲除组和患者组iPSC-CMs中显著上调。既往研究报道了PDGFRB信号通路调控心肌细胞增殖和再生、PDGFRB信号的过度激活与房颤和扩张性心肌病密切相关。研究者通过PDGFRB抑制剂或小干扰RNA（siRNA）等手段下调 PDGFRB水平后发现，患者组iPSC-CMs的钙超载和心律失常表型得到了明显恢复。因此，PDGFRB信号的异常激活是TRPM4 T262M突变导致心律失常发生的可能机制。
图4. 抑制PDGFRB活性有效逆转BrS患者iPSC-CMs中的心律失常和钙超载表型
综上所述，这项研究证实了临床筛查中发现的TRPM4基因突变（c.785C>T; p.T262M）可导致BrS的发生，应用iPSC-CM模型结合基因组编辑技术为该VUS位点的致病性鉴定提供了扎实的功能学依据。该研究发现了TRPM4相关BrS的新机制和潜在治疗靶点。
浙江大学转化医学研究院博士生王洪坤和浙江大学医学院基础医学院博士生徐丽臻为论文的共同第一作者，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属第一医院梁平教授为论文的通讯作者。同时，这项研究获得了浙江大学医学院基础医学院杨帆研究员、浙江大学医学院基础医学院祁鸣教授、温州医科大学附属第一医院黄周青教授、浙江大学生命科学学院余路阳教授、杭州市妇产科医院王昊副主任医师、浙江省人民医院韩帅主治医师的大力支持。