NSD蛋白家族是一类组蛋白赖氨酸甲基转移酶，在多种癌症中均存在扩增、变异、易位或过度表达情况。近年来，随着对NSD1、NSD2和NSD3结构和功能研究的深入，以及首个治疗滤泡性淋巴瘤和上皮样肉瘤的HKMTase抑制剂Tazemettostat的获美国FDA批准成功上市，NSD抑制剂的开发正如火如荼地进行。近日发表于JMC上的综述系统阐述了NSD酶的结构特征，总结了靶向催化SET结构域、PHD结构域和PWWP结构域的NSD特异性小分子抑制剂的研究进展。
NSD介绍
组蛋白赖氨酸甲基转移酶(Histone lysine methyltransferases, HKMTases)能够催化1-3个甲基转移到组蛋白H3和H4的特定赖氨酸残基(K3, K9, K20, K27, K36和K79)上，是一类表观遗传调节酶。HKMTases在基因调控、DNA复制和细胞分化等方面具有重要作用，因此受到广泛的关注。代表性的赖氨酸甲基化酶包括PRDM6、G9a、EZH2、DOT1L、NSD和SUV420H1等。
图：代表性的赖氨酸甲基化酶及其对组蛋白H3和H4的甲基化位点
组蛋白赖氨酸甲基化修饰主要由一类含有SET(suvar, enhancer of zeste, and trithorax)结构域的组蛋白甲基转移酶来执行。核受体结合SET结构域蛋白(nuclear receptor-binding SET domainprotein, NSD)家族是HKMTases中的一类，以S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)作为甲基供体，单甲基化和二甲基化组蛋白H3的36位赖氨酸(H3K36)。
图：NSD甲基转移酶对H3K36的单甲基化或二甲基化
NSD家族包括NSD1、NSD2(又称为MMSET或WHSC1)和NSD3(又称为WHSC1L1)三个成员，在多种疾病的发生和发展中都发挥着重要作用。比如，NSD1功能突变和缺失会引起索托氏综合征，NSD2的单倍体不足会导致心脏缺陷等。此外，研究表明NSDs的过度表达和改变与许多癌症相关。因此，NSD1、NSD2和NSD3被认为是开发新型抗癌药物的潜在靶点。
图：靶向NSD家族蛋白抗肿瘤小分子抑制剂
近年来，靶向组蛋白赖氨酸甲基转移酶的小分子抑制剂取得了一些研究进展。FDA已经批准EZH2抑制剂Tazemetostat(EPZ-6438)用于癌症治疗。DOT1L抑制剂Pinometostat(EPZ-5676)也在白血病患者中完成了第一阶段的临床试验。其他组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂，如G9a抑制剂UNC0642；PRDM9抑制剂MRK-740和SUV420H1/SUV420H2抑制剂A-196也被报道。此外，研究表明，小分子化学探针可以抑制NSD的甲基化活性，这些探针可以靶向NSD蛋白的催化SET结构域或其他功能域，包括PWWP结构域和PHD结构域。基于这些近期的研究，发现新型高效选择性的NSD抑制剂用于治疗癌症是值得期待的。
图：部分选择性组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂
组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD家族的结构
NSD1、NSD2和NSD3属于多结构域蛋白，包含脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸(proline-tryptophan-tryptophan-proline,PWWP)结构域、植物同源结构域(plant homeodomain, PHD)、催化SET结构域及其pre-SET结构域(又称为AWS)，post-SET结构域，以及NSD特异性的富含半胱氨酸组氨酸(C5HCH)的基序。
图：NSD家族蛋白结构域
NSD1、NSD2和NSD3在氨基酸残基703和1409之间有55%-68%的相同序列；高度保守的催化SET结构域和PHD结构域在转录调控和染色质重组中发挥关键作用；PWWP结构域对NSD与甲基化的组蛋白H3和DNA的结合至关重要，而PHD结构域在NSD与其他甲基化的组蛋白的相互作用中发挥着关键作用。
NSD1具有两种亚型，即由2696个氨基酸组成的长型NSD1和由2427个氨基酸组成的短型NSD1，两种亚型都包含两个PWWP结构域，五个PHD结构域，一个SET结构域及其pre-和post-SET结构域。
图：NSD1蛋白结构
NSD2是NSD家族中最短的蛋白，具有复杂的表达模式。NSD2有三种亚型：(i)长型NSD2，由1365个氨基酸组成；(ii)短型NSD2，由647个氨基酸组成；(iii)RE-IIBP(response element II-binding protein)，由584个氨基酸组成。长型NSD2包含两个PWWP结构域、一个HMG (high-mobility group) DNA结合域、四个PHD结构域、AWS、SET和post-SET结构域。短型NSD2由一个PWWP结构域和一个HMG结构域组成。RE-IIBP由两个PHD结构域、一个PWWP结构域和一个SET结构域组成，不含HMG结构域。
图：NSD2蛋白结构
从结构上看，NSD3在PWWP结构域的大小和数量上更类似于NSD2。NSD3分为长型NSD3(包含1437个氨基酸)、短型NSD3(包含645个氨基酸)和NSD3-whistle亚型(包含506个氨基酸)。长型NSD3包含两个PWWP结构域、五个PHD结构域以及pre-SET、SET和post-SET结构域。短型NSD3包含一个N端的PWWP结构域，这是该基因与H3K36结合所必需的。长型和短型两种亚型在肿瘤组织中共同表达，因此，它们通过类似的PWWP结构域，竞争性地与蛋白质相互作用。NSD3-whistle长度最短，包含一个PWWP结构域和催化SET结构域，NSD3-whistle通过促进H3K4和H3K27的二甲基化而作为转录抑制因子发挥着重要作用。
图：NSD3蛋白结构
NSD1、NSD2和NSD3包含高度保守的催化SET结构域。已报道NSD1的催化结构域晶体结构包括pre-SET、SET和post-SET结构域。其中SET结构域由三个β片层组成，即片层1(β1−β2)、片层2(β4−β5−β6)和片层3(β3−β7−β8)。它们在结构的中心呈三角形排列，αB螺旋位于β-片层2的相邻位置。SET结构域的一端通过一个N端的αA螺旋插入到β-片层1旁边，而另一端则通过AWS结构域插入到β-片层3旁边。S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)分子作为甲基供体，结合在SET和post-SET结构域之间。赖氨酸底物结合通道被一个由26个氨基酸残基组成的，连接SET和post-SET结构域的短规则loop阻断，该规则短loop(也称post-SET自抑制环)可以采用一种合适的构象以阻止H3K36接近SAM，这种自抑制构象能够阻止组蛋白赖氨酸底物进入活性位点，此外这种自抑制构象在另一种H3K36甲基转移酶ASH1L中也存在。自抑制post-SET环中的不同氨基酸残基通过氢键和疏水作用与β5和αB相互作用。
图：(A）NSD1催化结构域；(B)NSD1-SET催化结构域三维结构；(C)突变NSD3与H3共晶结构
分子动力学模拟研究表明，自抑制环的构象变化对组蛋白赖氨酸底物的进入和甲基转移酶的活性十分重要，对自抑制环的进一步动力学研究对于靶向NSD家族的药物设计具有重要意义。
研究表明，在没有底物的情况下，自抑制post-SET环会阻断NSD2和NSD3的底物结合位点。NSD与核小体表面或松散的DNA相互作用能够诱导自抑制环的打开，进而允许组蛋白赖氨酸底物进入NSD的催化位点。此外，结构分析表明致癌突变型NSD2和NSD3能与组蛋白形成新的氢键，进而增强NSD的催化活性。上图C说明了NSD3中与癌症相关的Thr1232氨基酸突变如何通过改变NSD3与核小体的分子间相互作用来增强其催化活性的结构基础。
此外，研究人员证实了NSD3的Thr1232变为Ala1232的癌症相关突变导致组蛋白H3的Pro38和His39主链更向突变的Ala1232区域移动，这种移动可能是由于Ala1232侧链的疏水性和尺寸小于Thr1232造成的。他们观察到两种新的分子间相互作用：(i)NSD3的Glu1231与H3组蛋白的His39之间的氢键;(ii)H3的Pro38主链原子与突变的Ala1232之间的氢键。这两个氢键是因为突变的Ala1232通过允许组蛋白底物H3K36进入催化口袋而增强了NSD3的催化活性时形成的。NSD2和NSD3对核小体H3K36甲基化活性的结构和生化研究结果同样为结构导向的药物设计以发现抗癌症的小分子NSD抑制剂提供了基础。
NSD1、2、3在癌症中的作用
尽管三种NSD蛋白在约700个氨基酸的模块内具有高度相似性，但它们具有不同的功能，原因在于其SET结构域可能具有不同的底物特异性。NSD1、NSD2和NSD3介导了不同的致癌机制。NSD1涉及NSD1-NUP98(核蛋白98)融合、NF-κB通路和CpG(胞嘧啶/磷酸/鸟嘌呤)岛启动子高甲基化；NSD2涉及NEK7、Wnt、NF-κB、γ-H2AX-MDC1通路和EZH2-microRNA-NSD2轴；NSD3则涉及NSD3-NUP98、BRD4-NSD3-CHD8、BRD8-NSD3-MYC的融合和NEK7、CCNG1、Wnt通路。
图：NSD3与其他蛋白融合诱导癌症
NSD家族蛋白与多种癌症的发生发展密切相关，包括前列腺癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤、急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌以及其他癌症，抑制NSD活性开始成为重要的抗肿瘤潜在靶点，开发靶向NSD家族蛋白的小分子抑制剂已经成为药物研发的重要方向之一。
NSD抑制剂的设计和药物化学
先前的研究
尽管许多研究证明了NSD1、NSD2、NSD3在各种癌症中的生物学功能，但由于生物分析方法和NSD抑制活性验证的诸多困难，以至于过去对NSD抑制剂的报道较少。此外，由于所有NSD甲基转移酶的SET结构域都存在一个独特的自抑制环，使其底物结合位点难以靠近， 选择性的有效NSD抑制剂开发工作因此受阻。在过去的几年里，研究人员一直致力于寻找高效的选择性NSD抑制剂，并以此为工具进一步阐述NSD的结构与功能。
此前，由于缺少NSD甲基转移酶的催化和功能位点的明确信息以及有效的H3K36甲基化体外分析方法，以至于难以直接设计靶向NSD的小分子。最初，研究人员从1040个化合物中筛选了抗寄生虫药苏拉明(suramin,1)和非特异性组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂毛壳素(chaetocin,2)，并鉴定两者具有非选择性的NSD抑制活性，IC50为2~21μM。
图：NSD抑制剂
同样，SAM的结构类似物西奈芬净(sinefungin,3)也具有非特异性的NSD抑制活性，IC50为46~150μM。基于西奈芬净设计的化合物N-丙基西奈芬净(4)和仲丁基西奈芬净(5)具有较强的NSD2抑制活性，IC50分别为3.3μM和1.8μM。
图：NSD抑制剂
G9a组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂BIX01294(6)和UNC0638(7)也可作为NSD甲基化抑制活性的先导分子。通常认为，靶向辅因子SAM结合位点(作为辅酶抑制剂)或NSD甲基转移酶SET结构域的组蛋白尾部结合口袋(作为底物抑制剂)能够抑制NSD甲基化活性。MCTP-39(8)是首个报道的SAM竞争因子作为NSD2抑制剂，其IC50小于3μM。BIX01294是非选择性的NSD抑制剂，对NSD1、NSD2和NSD3的IC50值分别为112μM、41μM和95μM。基于BIX01294设计得到的LEM-06(9)是一个靶向组蛋白尾部结合口袋的具有NSD2抑制活性的先导分子，IC50值为890μM。
图：NSD抑制剂
噻吩并[2,3-d]嘧啶化合物LEM-14(10)是首个NSD2选择性抑制剂，对NSD2的IC50为132μM，对NSD1具有较弱的抑制活性 (IC50>1000μM)，对NSD3则无抑制活性。分子对接研究发现10对所有NSD的组蛋白结合位点具有较强的结合相互作用，与NSD1和NSD3相比，10与NSD2活性位点的结合更稳定。基于10的优化得到的LEM-14-1189(11)是一种非选择性NSD抑制剂，活性有所提高(NSD1 IC50=418μM；NSD2 IC50=111μM；NSD3 IC50=60μM)。
O-取代的2-氨基-3-氰基吲哚化合物12是一种具有NSD2抑制活性(IC50=5.8μM)的先导分子，然而，该母核结构分子对NSD1和NSD3是否具有抑制活性还需进一步研究。
图：NSD抑制剂
利用高通量筛选方法从超过16000筛选发现了毛壳素(chaetocin,2)，DA3003-1(13)，PF-03882845(14)，TCLPA54(15)和ABT199(16)共5个化合物，体外实验表明它们可与催化SET结构域结合而发挥NSD2抑制活性，进一步分析发现对NSD1，NSD2，NSD3的抑制IC50为0.06-12μM。此外，在人骨肉瘤细胞U2OS中，DA3003-1(13)和PF-03882845(14)也表现出NSD2抑制活性。
最新的进展
近年来，开发有效的选择性NSD抑制剂用以癌症治疗的研究也取得了一些新进展。脂质纳米颗粒/siRNA制剂(17, LNP-siRNA)是一种针对NUP98-NSD1融合癌基因的急性髓系白血病新型治疗策略。含正亮氨酸肽18(PTD2)可在体外抑制NSD2(IC50=22μM)和NSD3(IC50=3.2μM)的SET催化结构域。
图：(A)LNP-siRNA; (B)PTD2; (C)DZNep
3-去氮腺嘌呤A(19, DZNep,S-腺苷同型半胱氨酸合成抑制剂)可抑制他莫昔芬耐药的癌细胞生长或存活，机制研究表明DZNep通过诱导NSD2蛋白的降解和活性氧依赖的凋亡，以及抑制NSD靶基因HK2(己糖激酶2)、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GLUT1(葡萄糖转运体1)和TIGAR(TP-53介导的糖酵解调节磷酸酶)的表达来实现癌细胞增殖抑制。有研究表明达沙替尼(dasatinib,20,酪氨酸激酶抑制剂)和navitoclax(21,BCL2抑制剂)的联合用药对NUP98-NSD1/FLT3-ITD驱动的AML具有协同治疗效果，这种联合用药可能是一种新的AML靶向疗法。
此外，开发靶向催化SET结构域、PHD和PWWP结构域的小分子NSD抑制剂的研究也取得了新进展。
01靶向NSD的催化SET结构域的小分子
研究人员利用基于片段的筛选策略从约1600类片段分子筛选得到6-氯-1,3-苯并噻唑-2-胺(22, BT1)，能够共价结合NSD1-SET结构域。22的类似物4-羟基-6-溴-1,3-苯并噻唑-2-胺(23, BT2)能够抑制NSD1甲基转移酶活性，IC50为66μM。
图：苯并噻唑-2-胺衍生物作为NSD-SET抑制剂
在23的6位引入硫氰酸酯基得到化合物24(BT3)，能与自抑制环中的Cys2062残基形成二硫键而发生共价结合。24与NSD1-SET结构域晶体结构显示，post-SET结构域的自抑制环通过构象变化形成独特的通道状口袋以结合小分子。基于构效关系的设计合成了甲基-氮杂环丙烷化合物25(BT5)，其对NSD1的抑制活性(IC50=5.8μM)明显增强，同时具有NSD2和NSD3的抑制活性(IC50分别为26.7μM和14.3μM)。细胞分析表明，25可选择性地结合HEK293细胞的NSD1-SET结构域。机制研究表明，25降低NUP98-NSD1靶基因HOXA9和MEIS1的表达，并通过削弱白血病细胞NUP98-NSD1活性而降低H3K36me2整体水平。
02靶向NSD的PHD结构域的小分子
NSD蛋白的PHD结构域是开发小分子NSD抑制剂的重要靶向位点。研究人员利用结构导向的计算机筛选和NMR验证方法确证了米托蒽酮二盐酸盐(26, 拓扑异构酶II抑制剂)、奎纳克林二盐酸盐(27,抗疟药物的吖啶类似物)和氯喹二磷酸盐(28, 抗疟药物)作为靶向NSD1-PHD的先导分子，这些化合物能够结合PHDVC5HCH，从而减少与Nizp1(NSD1-interacting Zn-finger protein)的C2HRNizp1(锌指结构域)的相互作用。这一研究为靶向NSD1的PHDVC5HCH和C2HRNizp1之间的锌指-锌指相互作用提供重要借鉴。
图：NSD1−PHDVC5HCH和Nizp1−C2HR 相互作用
03靶向NSD2-PWWP1结构域的小分子
NSD蛋白的PWWP结构域在NSD甲基转移酶活性中具有关键作用，因此，利用小分子干扰PWWP结构域的功能是抑制NSD活性的策略之一。有研究人员提出使用小分子阻断N端PWWP结构域与二甲基化H3K36之间的关键相互作用，可以用来开发新的NSD2抑制剂。
化合物32是首个靶向NSD2的PWWP1结构域的小分子拮抗剂。首先通过虚拟筛选和生物学分析，研究人员初步鉴定手性化合物29能选择性与NSD2的PWWP1结构域相互作用(Kd=41μM)。基于29的结构，使用配体导向的骨架跃迁等策略设计得到的化合物30作为先导化合物(Kd=175μM)，基于30的构效关系研究发现了活性更好的化合物31(Kd=7μM)。在此基础上进一步设计得到化合物32是NSD2的PWWP1结构域的选择性拮抗剂(Kd=3.4μM)，共晶结构表明化合物32与PWWP1的芳香性笼状结构具有结合相互作用。细胞实验证明32在人骨肉瘤细胞U2OS中能抑制H2K36me2的结合。这研究证明了通过靶向PWWP1结构域开新型NSD2抑制剂以治疗癌症的可能性。
图：靶向NSD2-PWWP1结构域小分子
另一项研究报道UNC6934(34)作为first-in-class有效化学探针，能够选择性结合NSD2甲基转移酶PWWP1结构域的芳香性笼状结构，抑制NSD2-PWWP1与H3K36me2核小体的相互作用。利用晶体学分析和分子对接模拟，对化合物32进行改造得到苯并嗪酮双环化合物33(MRT866) Kd值为349nM。进一步的结构导向优化得到的化合物34能选择性地结合到NSD2的PWWP1结构域，活性有所增加(Kd=91nM)。晶体结构证实34能竞争性地与NSD2的PWWP1结构域结合，阻断NSD2与H3K36me2结合。研究证明了化合物34可作为阐明NSD2其他生物学功能的工具，也可作为进一步开发为靶向NSD2的PWWP1结构域的NSD抑制剂的先导化合物。
04靶向NSD3-PWWP1结构域的小分子
基于片段的筛选发现了小分子化学探针BI-9321(37)，是NSD3-PWWP1结构域的选择性和强效的拮抗剂。首先，研究人员从1899种化合物中鉴定出先导片段35和36。共晶结构表明35和36能与NSD3-PWWP1结构域的芳香性笼状结构中的Tyr281、Trp284和Phe312残基相互作用，35的吡唑环和36的甲基二氢哒嗪环与Tyr281和Phe312存在π-π相互作用。同样，35的吡啶环和36的苯环很好地适应Trp284形成的亲脂平面，另外，35吡啶取代基的氮原子与Ser314形成氢键，36哌啶环的氮原子与Glu318形成氢键。
图：化合物35,36,37及其与NSD3-PWWP1相互作用
进一步的构效关系研究和结构导向设计得到化合物37，是一种有效的化学探针。37咪唑环的甲基与Trp284形成CH-π相互作用，氟喹啉核与Tyr281和Phe312形成π-π相互作用。此外，氟喹啉核的氮原子与Ser314形成氢键，3,5-二甲基苄胺的NH基团与Glu318形成氢键。化合物37可以选择性地结合NSD3的PWWP1结构域，其细胞活性约为1μM。在人AMLMOLM-13细胞中，37通过下调MYC的mRNA表达，表现出一定的抗增殖活性(IC50=26μM)。37可以作为一个小分子工具来探索NSD3的PWWP1结构域的生物学功能，也能为设计和合成NSD靶向的强选择性抗癌药物小分子提供思路。
总结
多项研究表明，NSD甲基转移酶在多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种人类癌症中均存在突变、扩增和过表达。本文总结了NSD的结构和功能，并阐述了靶向NSD的小分子抑制剂，以及特异性靶向催化SET结构域、PWWP结构域和PHD结构域等其他的功能结构域的小分子抑制剂研究进展。随着结构生物学的不断发展和对NSD甲基转移酶致癌机制理解的进一步深入，将进一步促进靶向NSD的小分子药物发现，相信在未来NSD抑制剂开发将会取得更多突破性的进展，为相关的疾病治疗带来惊喜。
参考文献：
1. AarajanaShrestha, Nayeon Kim, et al. Targeting the Nuclear Receptor-Binding SET DomainFamily of Histone Lysine Methyltransferases for Cancer Therapy: Recent Progressand Perspectives. J. Med. Chem. 2021, 64, 20, 14913–14929.