注入CRISPR/捐赠者负载的腺相关病毒载体（AAV/CRISPR）可以实现体内肝脏基因编辑，以补救遗传性凝血因子IX（FIX）缺乏的血友病B（HB）。然而，目前的治疗方案侧重于纠正F9编码区简单突变的HB，而忽略了那些携带涉及调节区的复杂突变。此外，与治疗相关的炎症可能产生的不利影响仍未得到解决。
2021年10月19日，来自上海交通大学陈赛娟等研究团队在Genome Biology上在线发表了题为“Inherent hepatocytic heterogeneity determines expression and retention of editedF9alleles post-AAV/CRISPR infusion”的研究论文，建立了一个适用于复杂的单基因疾病的AAV/CRISPR介导的基因编辑，强调了通过管理炎症提高治疗效果的潜力。
发生在X染色体F9位点的各种类型的遗传缺陷导致肝细胞不能产生凝血因子IX（FIX），从而导致血友病B（HB）。HB表现为残缺的出血性疾病，严重影响患者的发育和生活质量，是一种有代表性的单基因疾病，正在进行基因治疗的密集测试。目前的临床试验倾向于采用基因增强策略，即通过重组腺相关病毒载体（AAV）将外显体FIX表达盒送入肝细胞。
载体的一般结构包括一段特殊的序列，被称为倒端重复（ITRs），在FIX表达盒的两端侧翼。AAV的不同血清型有不同的组织特异性倾向，主要由其外壳决定。通过针对肝脏组织的AAV2或AAV8血清型载体，大量含有启动子-F9 cDNA盒的AAV基因组被送入单个肝细胞，在那里它们产生F9 mRNA。然而，由于这些外显体AAVs在宿主细胞中固有的不稳定性，它们的表达可能会下降到亚治疗水平。
另外，通过原位基因组编辑恢复肝细胞突变体F9（mF9）的编码功能的基因编辑方案，有望以更持久的方式产生FIX。在这方面，CRISPR-Cas9代表了一种有效的序列特异性基因组编辑工具，它包括一个目标序列配对的简单引导RNA（sgRNA）和一个DNA切割核酸酶Cas9。由此产生的DNA双链断裂（DSBs）将刺激内源性DNA修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）、同源定向重组（HDR）或同源非定向插入（HITI）。NHEJ，即用随机插入或删除几个碱基（indel）来重新连接DSB的两端，通常用于敲除某些目标基因，而HDR或HITI，由于有外源性供体模板，含有与DSB周围基因组序列同源的两个侧翼序列，即左同源臂（LHA）和右同源臂（RHA），是定向基因组替换或插入的基础，效率通常比NHEJ低得多。
以前的研究采用了由第8外显子内有12bp缺失的mF9引起的小鼠HB，证明了AAV/CRISPR策略的可行性，该策略是通过编码传递切割内含子1的SaCas9（金黄色葡萄球菌Cas9）/sgRNA和含有F9 cDNA第2至8外显子的供体来改善相关凝血病。DNA测序表明，通过HITI和HDR将F9 cDNA的第2至8个外显子精确插入mF9的内含子。
尽管如此，仍有几个问题有待解决，这有可能阻碍AAV/CRISPR介导的体内基因编辑的治疗应用。首先，HB患者中mF9的遗传缺陷呈现出多样化的形式，分散在其1至8号外显子和5′或3′调控区，AAV/CRISPR传递是否能有效纠正涉及增强子/启动子的更复杂的遗传缺陷所引起的HB凝血功能，目前尚不清楚。第二，负责在基因编辑后产生功能性FIX mRNA的确切主要肝细胞类型和DNA重组机制尚不清楚。第三，虽然AAV本身和转基因在肝细胞中的表达长期以来被认为是非致病性和低免疫原性的，但越来越多的证据积累表明，治疗性AAV输注到即使是未经刺激的受者体内，无论有无CRISPR编码传递，都会引发肝脏炎症。
这种炎症是否会破坏治疗效果在很大程度上还没有被探索。在这项研究中，我们证明了一个特定的AAV/CRISPR方案的有效性和安全性，该方案采用合成增强子/促进子整合和HDR介导的大DNA序列替换，处理携带复杂F9缺陷的严重HB模型。此外，基于肝脏组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）的系统分析表明，AAV/CRISPR输液引起的亚临床炎症以肝细胞亚群依赖的方式对编辑过的mF9等位基因的表达和保留产生了先前未被重视的负面影响。
该研究报告了一种合成的增强子/促进子（P2）的结合，使AAV/CRISPR有能力恢复涉及调节区的严重F9缺陷的FIX编码能力。系统分析显示，宿主细胞的异质性在决定该方案的治疗效果方面起着关键作用，其中，治疗后的亚临床炎症以肝细胞亚群依赖的方式调节P2活性和保留编辑过的F9等位基因。此外，造血细胞在肝脏的突出存在意味着它们参与助长和限制了这种肝脏炎症。总的来说，这些结果说明了决定AAV/CRIPSR介导的基因编辑在处理复杂的肝脏单基因疾病中的有效性和持久性的关键因素。
参考文献：
https://www.pnas.org/content/118/42/e2110887118