遇见-背景
药物在人体肝脏内能够被不同亚型的细胞色素P450酶代谢产生多种药物代谢产物（human drug metabolites），从而改变母药的活性、毒性、稳定性、水溶性以及生物利用度，因此药物代谢产物是药物开发过程所涉及药理学、药代动力学、药效学和毒理学研究中不可缺少的化学标准品物质。然而，这些在体内经由P450酶催化反应产生的代谢产物，往往具有高度的区域/立体选择性，通常难以通过化学方法直接合成；而人源P450酶由于其膜蛋白的性质，限制了其在异源宿主中的表达和应用；因此开发具有类人源P450酶功能的生物催化剂成为解决这一问题的有效途径。在先前的研究中，源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的脂肪酸氧化酶P450 BM3一直被作为潜在的生物催化剂原型进行研究，然而由于BM3结构中细长底物结合口袋的限制，天然的BM3并不能直接识别结构较大的药物分子，需要通过酶工程、定向进化等手段对其催化口袋进行改造，而该过程往往费时费力、效率不高。图片 图片
遇见-内容
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室李盛英教授课题组，发现链霉菌来源的P450酶PikC能够高效地催化氮烷基药物分子转化为相应的药物代谢产物。相关研究结果以“Bacterial Biosynthetic P450 Enzyme PikCD50N: A Potential Biocatalyst for the Preparation of Human Drug Metabolites”为题，发表于有机化学领域权威期刊《The Journal of Organic Chemistry》。硕士研究生郭嘉伟为论文第一作者，张兴旺助理研究员为论文通讯作者。
PikC是源自委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）苦霉素（pikromycin）生物合成途径中的可溶性P450羟化酶，其天然功能是催化12/14-元大环内酯底物YC-17/narbomycin的羟基化。前期的结构生物学研究发现，底物结构中的氮二甲基基团能够和PikC催化口袋中特定位置的酸性氨基酸形成盐桥，从而使催化位点接近PikC的“血红素-铁”催化中心完成反应，这一特殊的“锚定”机制对PikC的底物识别和催化选择性至关重要（J. Biol. Chem. 2006, 281, 26289; 2009, 284, 5723）。随后的底物工程研究发现，能够通过将天然或化学合成的氮二甲基基团连接于非天然底物从而实现PikC的催化（图1. P. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 18463; J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 4901; Nat. Chem. 2015, 7, 653）。
图1：PikC“底物工程”策略的进化
本研究受到PikC-底物相互识别机制及底物工程进化历程的启发，选择了19种具有不同治疗作用和结构类型，但结构中同时含有氮二烷基基团的临床药物，与先前构建的高催化活性突变体PikCD50N进行体外反应，结果发现PikCD50N能够将其中的15种药物（化合物1-15，图2）转化为多种代谢产物。通过HR-MS, NMR, GC-MS和HR-MS/MS对产物结构进行鉴定，发现PikCD50N催化药物分子的反应具有多样化的反应类型，包含羟基化、连续氧化、去N-烷基化、N-氧化、S-氧化和二聚化等。通过产物结构比较，发现PikCD50N的代谢产物与人体肝脏P450酶催化产生的人体药物代谢产物具有极高的覆盖度和相似性（所鉴定的55种产物中有45种产物结构与人体药物代谢产物结构一致）。
图2：本研究中使用的药物分子化学结构（氮烷基基团以蓝色突出显示）。
随后，作者以PikCD50N催化的中枢神经系统药物氯丙嗪（Chlorpromazine，1）代谢反应为模型，探究了不同还原伴侣对产物分布的影响（图3），发现不同的还原伴侣能够改变PikCD50N的产物谱，说明还原伴侣在药物代谢产物制备中能够发挥“调节器”作用，用于选择性制备不同产物。值得一提的是，低成本的H2O2也能够高效地支撑PikCD50N催化药物分子的代谢反应，从而避免了复杂还原伴侣系统及昂贵辅因子NADPH的使用（图3）。此外，酶动力学研究发现，PikCD50N对1的催化效率（kcat/Km = 1.59 ± 0.92 μ.-1min-1）甚至远高于其天然底物YC-17（0.24 μM-1min-1）。为了验证PikCD50N作为生物催化剂制备药物代谢产物的可行性，作者于100 – 200 mL的放大反应体系中进行了PikCD50N-1反应，结果发现PikCD50N在放大反应体系中能够维持原来的催化效率和产物分布，通过制备HPLC的分离纯化，顺利得到了毫克级别的多种药物代谢产物。
图3：不同还原伴侣和H2O2支撑PikCD50N-1反应HPLC分析结果。
最后，作者通过蛋白分子对接实验结合P450酶的催化机理，对PikCD50N-1反应产物多样性的产生机制进行了探讨。蛋白结构比较发现，与P450 BM3相比，PikCD50N具有与人体肝脏中药物代谢主要亚型P450 3A4更为相似的底物结合口袋（图4），预示着PikCD50N是更具天然优势的生物催化剂开发模型。
图4：PikCD50N-1分子对接实验（上图）和PikCD50N/BM3/3A4底物结合口袋（高亮显示）比较。
本研究首次发现来源于链霉菌生物合成途径中的P450酶PikCD50N具有类人源P450酶催化功能，并且PikCD50N催化药物代谢反应拥有可塑性强、成本低、催化效率高、底物范围广等优点，具备在药物工业中的实际应用潜力。本研究也为今后PikC及其它生物合成P450酶新功能的开发提供了借鉴。