遇见-摘要
合成生物学利用微生物宿主生产来源于稀有或难以培养生物体中的复杂分子，但这些分子结构仅限于由天然酶催化形成。将人工金属酶(ArMs)整合到代谢网络中，可以丰富分子合成途径。本文作者报道一种用于异源表达生物合成途径的工程化微生物细胞，该途径包含天然酶和含有铱-卟啉复合物的ArM，通过异源转运系统将该体系转运到细胞中以较高非对映选择性催化萜类化合物的环丙烷化反应。本文将合成生物学和合成化学整合为人工生物合成相关研究提供范例。
遇见-内容
本文作者生产非天然萜类化合物的总体策略如图1所示，ArM在辅因子转运系统和载脂蛋白的协助下在大肠杆菌中进行组装，并且同一大肠杆菌包含编码作为ArM底物的天然产物生产途径的质粒。在同一细胞中将天然和人工反应结合以产生天然产物的人工衍生物。
在体内组装ArM。作者首先解决第一个主要挑战：在细胞质中组装ArM。为在大肠杆菌细胞质中构建人工酶，辅因子需穿过细胞膜和周质。相关研究中过表达外膜受体ChuA可以使金属取代的血红素衍生物跨细胞膜转运，本文作者将血红素转运蛋白ChuA和CYP119共表达使人工辅因子Ir(Me)MPIX转运到大肠杆菌中并整合到细胞质中apo-CYP119突变体中。为测试Ir-CYP119在过表达ChuA的大肠杆菌细胞质中的组装和催化作用，作者研究(-)-香芹酮的环丙烷化反应。
作者在之前研究中，Ir(Me)MPIX和纯化的apo-CYP119突变体体外重组产生的Ir-CYP119催化(-)-香芹酮与重氮乙酸乙酯(EDA)的环丙烷化反应，非对映体比例d.r.为8:1:1:1，而由游离铱-卟啉复合物催化的类似反应d.r.值对应为1:1:3:3，因此可以通过产物d.r.值反映细胞中ArM反应是否组装成功。
ACS Cent. Sci. 2017, 3, 302−308
作者在共表达血红素转运蛋白ChuA和CYP119突变体的大肠杆菌细胞中补充10μMIr(Me)MPIX，全细胞反应后d.r.值为1.7:1.0:2.7:3.3（补充图1a），表明全细胞体系大部分产物是游离的铱-卟啉复合物催化产生，而非组装的ArM。
为减少游离铱-卟啉复合物对反应的干扰，作者考察不同浓度Ir(Me)MPIX条件下(-)-香芹酮与EDA反应，结果如图2a所示，Ir(Me)MPIX浓度较低时相关产物d.r.值较高(23:3.5:1.0:1.2)。
为提高细胞摄取Ir(Me)MPIX效率，作者将ChuA转运蛋白替换为hug操纵子。由表达HUG转运系统的大肠杆菌细胞催化(-)-香芹酮与EDA反应，并与CYP119（由lacUV5启动子表达）协同，相关环丙烷产物的d.r.值很高（图2b）。接下来作者通过电感耦合等离子体质谱法分析铱的分布以阐明组装含有HUG转运系统的ArM高效的原因，通过电感耦合等离子体质谱法分析铱的分布，结果表明大部分铱主要位于细胞质中，HUG系统显著增强Ir(Me)MPIX在细胞质中的吸收（图2c）。
环丙基柠檬烯的生物合成。下一步作者将该体系应用于柠檬烯衍生物的生产（图3a）。柠檬烯产率不受CYP119表达水平的影响（图3b）。然后作者评估添加到全细胞体系中柠檬烯的环丙烷化反应，产物d.r.值为1.0:3.3:1.1:1.0，主产物P2比例比体外反应更高，作者推测可能由于体内酶稳定性更高或者体内游离辅因子活性更低（图3c）。构建相关反应后环丙基柠檬烯主产物的比例为43% ± 2%（图3d）。
增加非对映选择性和滴度。为增加人工途径合成环丙基柠檬烯的非对映选择性和滴度，作者对CYP119突变体进行蛋白质工程改造。通过对辅因子结合位点周围氨基酸进行突变，并结合在体内组装功能性Ir-CYP119以更快筛选突变体，P/R256W/V254A产率和非对映选择性较高（图4a、b）。作者通过分批添加EDA发现环丙基柠檬烯的滴度提升并且非对映选择性基本不变（图4c）。
总之，本文作者构建异源天然产物生物合成途径并结合人工酶Ir–CYP119（含有Ir（Me）MPIX作为异源辅因子）催化萜类化合物的环丙烷化反应，展现出将人工酶催化的非自然反应与天然生物合成途径相结合的可行性，在未来人工生物合成将进一步整合生物合成天然酶和人工酶以丰富分子合成模式。