01
遇见/摘要
通过酶法还原胺化反应可以高效制备手性胺类化合物。本文研究人员发现并改造还原胺化酶RedAm用于含四元环酮结构底物的还原胺化反应，对RedAm进行蛋白质工程改造在生产规模下以高收率、高纯度、高选择性制备数吨JAK1抑制剂abrocitinib，拓展RedAm 在工业生产的相关应用。
02
遇见/内容
RedAm酶的路线选择和鉴定。Abrocitinib属于JAK1抑制剂，化合物1是其合成关键手性中间体，但利用烷基胺对前体酮直接进行选择性还原胺化反应充满挑战，特别是对于含有四元环酮结构的相关底物（图1）。
研究人员首先对辉瑞公司酶库进行筛选，发现并鉴定可以高选择性催化1顺式异构体生成的还原胺化酶SpRedAm，但野生型酶随着底物负载量增加转化率降低，不适用于商业化过程中100 g l-1 的目标底物负载量。
酶工程改造。研究人员接下来通过酶工程改造以提高SpRedAm野生型酶的性能，目标是提高底物耐受性和活性，同时保持高选择性（表1）。
研究人员设计并应用多种蛋白质工程改造方法，包括基于计算和生物信息学选择初始位点，以及数据驱动下关键残基的确定与协同重组。最初文库设计选取296个残基中的93个位点用于位点饱和诱变(SSM)，其中最好的突变体活性提高五倍（图2）。
下一步研究人员进行多轮组合突变，确定来自第3轮的突变体R3V6用于反应和工艺开发（图3-4）。
在SpRedAmR3V6的四个突变位点中，只有F180M作为酶活性位点残基直接与底物相互作用。而其他三个突变N131H、A170C和G217D与活性位点残基产生相互作用。此外A170C和F180M在与底物结合时构象发生变化（图5）。
工艺开发。研究人员将SpRedAmR3V6用于商业化工艺设计和开发，首先通过筛选、确定利用GDH辅因子循环体系进行工艺开发，此外筛选并优化反应温度、pH、底物负载、酶负载、葡萄糖负载、辅因子NADP+负载和甲胺浓度，以确定实现高转化率和选择性的最佳反应条件，最终以高收率、高纯度、高选择性成功以生产规模制备琥珀酸盐形式的1（图6）。
本文研究人员发现、改造并应用RedAm催化酮与甲胺的直接还原胺化反应，以生产规模制备高纯度、高选择性仲胺产物—JAK1抑制剂abrocitinib，为绿色生物催化方法在药物关键中间体制备相关应用提供范例。
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