摘要
近日，北京化工大学生命科学与技术学院袁其朋课题组在《Metabolic Engineering》杂志发表题为“Design and construction of an artifcial pathway for biosynthesis of acetaminophen in Escherichia coli”的研究论文，报道了一条全新的对乙酰氨基酚生物合成途径。
内容
对乙酰氨基酚 (AAP)，也称为扑热息痛，被世界卫生组织（WHO）列为基本药物之一，主要用于治疗疼痛和发烧。它是许多著名的非处方药物的活性成分，如Tylenol、Panadol和Excedrin。2021年全球对乙酰氨基酚市场规模将达到7.723亿美元，预计2025年将达到 7.932 亿美元。目前，对乙酰氨基酚的工业生产依赖于以化石能源为原料的化学合成。然而，这些生产方法需要严格的反应条件、会产生较多副产物、对环境不友好，不利于可持续发展。构建以可再生资源为原料生产对乙酰氨基酚的微生物细胞工厂是解决该问题的关键方法。然而，由于对乙酰氨基酚是人工合成的化学物质，不存在天然的生物合成途径。因此，需要为其生产设计一条人工生物合成途径。
该研究团队报道了一条以甘油为原料从头生物合成对乙酰氨基酚的新型人工途径（如图1所示）。
图 1. 对乙酰氨基酚从头生物合成的新型人工途径。
该研究团队采用 “自下而上”的设计思路，对可能存在的途径进行了探索。首先，通过分析对乙酰氨基酚的化学结构，推测其可以通过N-乙酰化对氨基苯酚（p-AP）生产。因此，挖掘催化该反应的酶成为研究的重点。芳基酰胺酶 (AAA) 属于羟化酶家族，可以将苯胺水解成羧酸盐和芳基化合物。有报道显示其可以通过添加高浓度的对氨基苯酚和乙酸在酸性条件(pH 5.5)下产生对乙酰氨基酚(图2A CX1)。然而，大多数微生物宿主在温和的条件（pH 7）下生长，该酶催化的反应的吉布斯自由能(ΔrG,。net)为13.5 kJ/mol，在微生物体内不利于对乙酰氨基酚的合成，更倾向于降解(图2B)。在实验过程中，研究团队发现大肠杆菌自身也可以催化对氨基苯酚产生对乙酰氨基酚(图2A CX2)，表明大肠杆菌存在内源酶可以实现对氨基苯酚的N-乙酰化。经数据分析，大肠杆菌中存在一种N-乙酰转移酶(NhoA)，推测该酶可以乙酰辅酶A作为酰基供体催化对氨基苯酚生成对乙酰氨基酚，该反应的吉布斯自由能(ΔrG,。net)为-17.5 kJ/mol，有利于对乙酰氨基酚在生物体内的合成。通过添加实验，验证了来自大肠杆菌的NhoA，可以催化对氨基苯酚至对乙酰氨基酚的高效转化，转化率高达75%(图2C)。
图 2. 对氨基苯酚N-乙酰转移酶的筛选和表征。
解决了对乙酰氨基苯酚的生物合成前体后，缺乏其前体对氨基苯酚的生物合成途径是对乙酰氨基酚生物合成的另一个挑战。在结构上，对氨基苯酚与对氨基苯甲酸（p-ABA）非常相似，而对氨基苯甲酸是微生物合成叶酸的天然中间体，具有天然的生物合成途径。因此，拟选择合适的酶催化对氨基苯甲酸转化为对氨基苯酚。在分析了对氨基苯酚和对氨基苯甲酸的化学结构后，单加氧酶可以作为一种备选酶实现对氨基苯甲酸脱羧还原生成对氨基苯酚。然而，尚未有催化该反应的酶的报道。该团队根据酶的杂泛性，以催化相同反应类型和催化底物相似为原则，筛选了5种单加氧酶，最终成功筛选出高效的对氨基苯甲酸单加氧酶MNX1，其可以催化800 mg/L对氨基苯甲酸生成553.31 mg/L对氨基苯酚（图3）。
图 3. 通过鉴定对氨基苯甲酸单加氧酶将对氨基苯甲酸生物转化为对氨基苯酚。
为了提供充足的前体对氨基苯甲酸，该研究团队通过增强莽草酸途径的通量并过表达对氨基苯甲酸合成酶，对氨基苯甲酸的产量达到836.43 mg/L。随后，对整个途径进行了组装，成功实现了对乙酰氨基酚的从头生物合成，产量为14.32 mg/L（图4）。然而，由于NhoA不仅可以催化对氨基苯酚的乙酰化，还可以催化对氨基苯甲酸的乙酰化生产对乙酰氨基苯甲酸（p-Acetylaminobenzoic acid）（图2C，图4），并且该酶对对氨基苯甲酸的亲和力更高，导致了大量副产物的生成，大大降低了对乙酰氨基酚的生成效率。通过采用温度响应控制系统调控NhoA的表达，减少了副产物的积累，大大提高了产量，最终对乙酰氨基酚产量达到了120.03 mg/L（图5）。这项工作首次通过设计和构建人工生物合成途径实现了微生物生产对乙酰氨基酚，为从可再生碳源大规模生物制造对乙酰氨基酚提供了可能。
图 4. 在大肠杆菌中利用甘油从头生物合成对乙酰氨基酚。
图 5. 采用温度响应控制系统从头生物合成对乙酰氨基酚。
上述研究工作得到国家重点研发计划（2018YFA0901400和2018YFA0903000）、国家自然科学基金（22078011，21908003 和 21636001）的支持。申晓林副教授和研究生陈昕为该论文共同第一作者，通讯作者为北京化工大学王佳副教授和袁其朋教授。
致谢
感谢袁其朋教授课题组对本号的支持，感谢文章作者申晓林和陈昕提供本文稿件支持！
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