在修复CRISPR-Cas9裂解引起的双链断裂（DSBs）后，基因组损伤，如大面积缺失，可能会产生致病的后果。
2021年8月20日，来自中国医学科学院血液病研究所张孝兵和程涛等研究团队在Genome Biology上在线发表了题为“Effective control of large deletions afterdouble-strand breaks by homology-directed repair and dsODN insertion”的研究论文，发现通过HDR和NHEJ及时桥接断端，大大减少了dsDNA裂解的意外后果。这些策略可以在基因编辑应用中加以利用，以减少意外的结果。
CRISPR-Cas9是一种RNA引导的DNA内切酶系统，针对特定的基因组序列。在CRISPR介导的双链DNA（dsDNA）裂解后，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行基因组编辑，改变了细胞和基因治疗的领域。CRISPR-Cas9系统在人类基因治疗中的潜在应用已被认可并被广泛研究。在进入临床之前，必须彻底调查基因组编辑的非预期后果。
最初对脱靶活动的担忧已经通过开发敏感的检测方法，以及改良的Cas9酶和改进的传递方案来解决，以限制这种类型的损害。除了脱靶效应，PCR和第三代测序技术的结合，使得基因编辑细胞和人类胚胎的靶点频繁出现大片段缺失（千碱基规模），甚至复杂的基因组重排。与PacBio平台相比，基于纳米孔的技术通过监测DNA分子通过一个孔并测量电流或光信号的变化来检测DNA碱基。由牛津纳米孔技术公司（ONT）商业化的纳米孔测序，可以产生高产量的100多千字节（kb）的超长读数。它的便携性、经济性和数据生产的速度使它适合于全面调查基因组编辑相关的大面积缺失。
尽管由Cas9和单向导RNA（sgRNA）引入的DNA断裂在小鼠和人类细胞中经常解决为延伸超过数千碱基的缺失，但很少有研究探讨临床相关细胞中的大片段缺失。仔细评估具有临床意义的细胞类型，如人类原始T细胞、造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及人类诱导多能干细胞（iPSCs）中的大片段缺失，对其临床转化至关重要。更重要的是，开发减轻这种不利影响的策略是进一步推进这一领域的先决条件。
该研究假设利用DNA损伤修复途径将有效地遏制DSB诱导的大量缺失。对于精确的基因敲入，通常提供带有同源臂的模板来指导HDR修复。主要的HDR供体类型是质粒供体和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）。以前曾报道过使用质粒供体在细胞系和人类iPSCs中进行高效的HDR编辑。然而，质粒供体由于激活了细胞膜DNA感应途径，往往会引起严重的细胞毒性。相反，腺相关病毒（AAV）载体已被成功用作HDR模板。
该研究通过PCR和纳米孔测序，确定了CRISPR-Cas9诱导DSBs后人类T细胞和HSPCs中多个位点的大片段缺失。此外，首次表明，AAV6供体介导的HDR几乎可以废除，而NHEJ介导的dsODN插入可以减弱大片段缺失，为这种阻碍基于基因组编辑疗法临床转化的不良反应提供解决方案。
参考消息：
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02462-4
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