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傅氏共振能量转移（FRET）生物传感器的灵敏度有限，阻碍了其更广泛的应用。
2021年8月19日，来自浙江大学孙洁以及加州大学WangYingxiao等研究团队在Nature Communications上在线发表了题为“Integrationof FRET and sequencing to engineer kinase biosensors from mammalian celllibraries”的研究论文，开发了一种整合高通量FRET分选和下一代测序（FRET-Seq）的方法，利用自激活FRET（saFRET）生物传感器的设计，直接在哺乳动物细胞中从大规模文库中识别具有不同底物序列的敏感生物传感器。
基于福斯特共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器已经彻底改变了活体细胞中分子信号（如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质激活、离子和小分子动态）的成像，具有高时空分辨率。然而，这些生物传感器的有限灵敏度阻碍了在细胞研究和药物筛选中的更广泛应用。目前，FRET生物传感器的优化设计往往受到准确的蛋白质结构的限制。
为了解决这些问题，已经提出了几种利用细菌和酵母的进化策略的方法。虽然这些方法设计得非常好，但它们通常需要额外的选择步骤来确定优化的FRET生物传感器，因为来自纯化的蛋白质或细菌/酵母的结果不能直接转化为哺乳动物细胞中的生物传感器反应。已经在哺乳动物细胞中建立了定向进化平台，以进化转录因子和G蛋白偶联受体（GPCRs），并利用一个机器人细胞采摘系统与显微镜相结合，优化电压报告器的亮度和膜定位。
哺乳动物细胞中FRET生物传感器的相对小规模库（≤100个变体）的半理性设计也已被开发出来，以改善RhoA FRET生物传感器。然而，没有一种方法可以直接在哺乳动物细胞中设计和筛选相对大规模的FRET生物传感器库（例如，数万个或更大），以高通量的方式识别敏感的生物传感器。
FRET生物传感器提供了一个强大的平台来量化T细胞中的生化和生物力学信号的动态变化。基于T细胞的免疫疗法，例如CAR-T疗法，已经彻底改变了癌症治疗。第二代设计的嵌合抗原受体（CAR），在CAR的细胞质尾部含有CD28或4-1BB衍生的成本刺激结构域，已被广泛应用于临床。这些CAR分子的不同设计，在CAR的细胞质尾部有不同的基于免疫受体酪氨酸的激活图案（ITAMs），已被证明在体内具有不同的抗肿瘤效力。然而，ITAM调节CAR-T细胞功能的机制仍不清楚，这对设计下一代CARs至关重要。
酪氨酸激酶，包括Fyn和ZAP70激酶，作为ITAM和TCR/CAR细胞质尾部的关键媒介。监测这些激酶为研究ITAM的功能提供了一个强有力的手段。同时，ZAP70在T细胞信号传导中起着关键作用，并参与了各种疾病。例如，ZAP70中的R360P突变引起的TCR信号的升高，导致了临床上的自身免疫表型，其特征是大疱性皮炎、蛋白尿和结肠炎。然而，由于目前可用的ZAP70 FRET生物传感器的灵敏度较低，以及ZAP70激酶的内在活性相对较弱，导致检测困难，所以目前还没有现成的方法来测量活细胞中与生理有关的ZAP70活性，以研究ITAM在调节TCR/CAR功能中的作用。
尽管ZAP70激酶在T细胞功能和相关疾病中起着关键作用，但目前还没有针对ZAP70的有效抑制剂。高通量药物筛选（HTDS）是识别激酶抑制剂的有效方法，但主要局限于传统的体外酶学试验。FRET生物传感器可以作为评估活细胞中激酶抑制剂及其相关治疗药物的有力工具。
然而，尽管FRET生物传感器在监测胰岛素受体激活和PKA激酶活性的筛选试验中成功整合，但基于FRET的生物传感器还没有被广泛用于筛选激酶抑制剂，主要原因是FRET生物传感器的动态范围相对较小，低于HTDS检测所需的最小20%动态范围。此外，这些传统的FRET-HTDS测定不能区分上游信号分子的抑制剂和直接针对激酶本身的抑制剂。各个宿主细胞中激酶活性的异质性水平可能给基于FRET的筛选平台带来额外的噪音和困难。因此，需要一种不同的具有高灵敏度的生物传感器的FRET筛选设计，以高通量的方式筛选激酶抑制剂。
利用与活性激酶结构融合的自激活FRET（saFRET）生物传感器，该研究展示了开发的一种方法，将FRET信号与哺乳动物细胞中生物传感器库的下一代测序（NGS）（FRET-Seq）结合起来，以提高生物传感器的性能。这个FRET-Seq平台已被应用于以高通量方式改进Fyn和ZAP70生物传感器，改进后的ZAP70生物传感器被进一步应用于单T细胞和CAR-T细胞成像。此外，开发了一种基于saFRET的HTDS检测方法来筛选化合物库，并确定了高效的ZAP70激酶抑制剂，可以抑制由病理性ZAP70突变引起的T细胞激活。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25323-x
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