遇见/摘要
柠檬烯（Limonene）是一类重要的单环单萜类化合物，在食品、化妆品、航空燃料等领域具有十分重要的应用。合成生物学及代谢工程的发展，为高效、可持续地提供柠檬烯开辟了新方法。
近期天津大学合成生物学团队赵广荣教授课题组在Biochemical Engineering Journal上发表论文“Combinatorial engineering of Saccharomyces cerevisiae for improving limonene production”，通过组合代谢工程，对酿酒酵母进行改造，提高了柠檬烯的产量和产率。
遇见/内容
作者将正交柠檬烯合成途径整合到酿酒酵母的多拷贝δ位点上，发现不同克隆间柠檬烯产量的产量有所不同，推测可能是由于整合拷贝数不同造成的。随后通过qPCR确认了不同克隆的整合拷贝数，发现整合拷贝数较多时柠檬烯的产量较高（Fig. 2）。
对PDH旁路途径进行优化，增加MVA途径的代谢通量。但是过表达内源的ADH2、ALD6和ACS2却使柠檬烯产量下降，经过分析发现是由于过表达ADH2和ALD6造成了乙酸的积累（Fig. 3C），而内源的ACS2不能有效的将乙酸转化成乙酰辅酶A。引入更为高效的外源的乙酰辅酶A合成酶SeACSL641P，有效缓解了乙酸的积累，最终柠檬烯产量提高了11.92%（Fig. 3B）。
作者又探索了PAH1、ROX1、GDH1、GDH2、CIT2、MLS1等非MVA途径基因的敲除在短期和长期发酵条件下对柠檬烯合成的影响，发现ROX1、GDH1、GDH2和CIT2的敲除在两种条件下均能不同程度地提升柠檬烯产量(Fig. 4A, B)。
将优化后PDH旁路途径与有效的基因敲除进行组合，结果优化后的PDH旁路途径与敲除CIT2的组合效果最好。考虑到底物供应被加强，为了实现有效转化，又引入了包含柠檬烯合成模块的质粒，使柠檬烯的产量提高了60.22%（Fig. 5）。
最终以20g/L葡萄糖为初始碳源，随后7次共补加45g/L乙醇作为补料碳源，经过168小时发酵，最终柠檬烯产量达到了2.23g/L（Fig. 6）。
该研究表明代谢改造后酿酒酵母具有工业化生产柠檬烯的潜力，同时为酿酒酵母合成其他单萜类化合物提供了参考。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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