膜龈手术已成为牙科临床上常见的牙龈软组织修复手术，主要依靠自体移植或商业胶原膜(CM)。然而自体移植物在来源可用性和术后长期疼痛管理方面面临巨大挑战，CM受限于其在水性环境中较差的机械性能。壳聚糖是一种天然多糖，具有良好的生物相容性、抗炎性和生长性能。而冷冻干燥作为一种可行的三维多孔支架生成方法，在组织工程中得到了广泛应用。通过控制冷冻过程的参数，可以精确调节冻干三维支架的形貌和力学性能，将其用于制造具有均匀互连孔的分级支架，这些孔对于引导或引导细胞粘附和渗透至关重要。
鉴于此，同济大学附属口腔医院王佐林主任医师、中科大俞书宏院士、高怀岭副教授合作通过双向冷冻法制备了具有长程有序多孔结构的仿生层状壳聚糖支架(LCS)，该支架可作为一种有前途的牙龈组织工程材料。LCS不仅在水合状态下表现出优异的机械性能，而且在体内加速血管形成和软组织再生。最有趣的是，发现LCS能够诱导巨噬细胞分化为M2巨噬细胞，这被认为在组织再生中起重要作用。这些优势加上其简单和低成本的制备工艺使LCS成为牙科临床应用的一个有前景的候选。相关工作近期以题为“Biomimetic Lamellar Chitosan Scaffold for Soft Gingival Tissue Regeneration”发表在了《Advanced Functional Materials》上。
【LCS的制备与表征】
三维宏观尺度的LCS是通过取向冷冻法制造的。在冷冻过程中，在水平方向和垂直方向温度梯度的驱动下，壳聚糖溶液中会形成层状平行排列的冰晶。然后，分离的正在生长的层状冰晶将先前分散的壳聚糖分子推入它们的界面，在冻干后形成最终的多孔层状支架。所制备的LCS被发现具有高度的柔性和吸水性，LCS的孔隙度测量值高达约96.7%，可以吸收高达自身重量2331%的水。这一特性赋予了LCS独特的形状记忆能力，被挤压的LCS在再次快速吸水后可以恢复到原来的形状。与商业胶原膜(CM)相比，LCS被测试显示出优异的机械强度。含水LCS的抗拉强度可达约15Mpa，与含水CM的抗拉强度(仅3.7Mpa帕)形成鲜明对比。此外，含水LCS的韧性为4 MJ m−3，远高于CM。并且含水LCS显示出与最大应变约相当CM 60%的拉伸性。这些坚固的机械性能将有助于进一步的手术操作，并为细胞粘附和增殖提供相对稳定的环境。
层状壳聚糖支架的制备及应用示意图
LCS的形态和力学性能
【细胞在LCS上的粘附、迁移和增殖】
为了研究LCS的生物相容性，牙龈间充质干细胞(GMSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)与LCS共培养，在共培养第7天，LCS组的光密度(OD)值高于CM组，LCS独特的多孔结构能够和细胞之间更紧密的相互作用，从而进一步促进细胞增殖。
细胞对LCS的反应
【LCS的皮下植入】
为了进一步研究LCS在体内的生物降解和组织再生能力，将5 mm × 5 mm × 2 mm (L × W × H)正方体的LCS和CM分别植入24只小鼠的背部皮肤下。随着时间的推移，每组在第7天观察到大量细胞迁移，并有成纤维细胞浸润，在第14天，LCS组新血管形成更明显。LCS组在第7天和第14天显示出比CM组更高水平的I型胶原染色，可以推断LCS新形成的组织由I型胶原组成，与原始牙龈结缔组织一致。然后通过免疫化学系统地研究新血管形成和生长-生物降解同步性，以确认新组织的产生。LCS在这项工作中可以更快地完成身体的血管化，而不会陷入广泛的炎症或纤维化，从而加速新纤维的再生。
LCS植入小鼠背部皮肤的组织学分析
【LCS种植可促进大鼠牙龈软组织再生】
为了评估LCS对牙龈再生的影响，在大鼠中进行了粘膜牙龈手术。然后用紧密的缝合线将LCS和CM移植到大鼠下颌骨的粘膜和骨膜之间。移植后7天，LCS开始生物降解，并与H&E染色证实的新形成的纤维很好地结合。LCS组在第14、21和28天的牙龈厚度均大于CM组。
LCS种植对大鼠牙龈组织再生的影响
【LCS促进组织再生机制】
炎症是身体对工程组织的正常生物反应，研究人员在原位实验中获得了最佳和快速的组织再生，然后系统地评估了炎症反应，以进一步确认新组织形成的可能机制。巨噬细胞在炎症和组织修复中起着关键作用，。促炎和抗炎信号级联对于组织结构的快速解析和恢复都是必要的。有两种类型的巨噬细胞被称为M1(经典激活-促炎)和M2(交替激活-抗炎)。它们的功能是促进病原体的杀死，驱动炎症反应，并上调细胞因子分泌以激活组织修复。为了进一步研究巨噬细胞在体内对不同物质的反应，对植入LCS和CM的小鼠背部皮肤进行了免疫荧光染色和蛋白质印迹。7天和14天后，LCS组可明显观察到CD206阳性巨噬细胞的浸润。同时检测了M1和M2的蛋白质标记物CD80、CD86、CD163和CD206的蛋白表达。定量结果表明，CD163在LCS组的表达明显高于CM组。推断LCS可能通过极化巨噬细胞促进血管生成、成纤维细胞增殖和胶原合成。
LCS的宿主响应
【总结】
在这项研究中，研究人员引入了一种具有高度有序多孔层状结构的有效LCS修复牙龈软组织缺损。LCS的分层多孔结构不仅模仿了牙龈的结构，而且在水合状态下赋予了自身优异的机械强度和形状记忆功能。所制备的LCS表现出良好的细胞反应和亲水性，这赋予其在促进细胞附着和增殖方面的优异性能。此外，三维结构允许LCS在网络中装载不同种类的细胞。LCS还显示出良好的生物相容性，并且在体内诱导了比常规胶原膜更多的血管和纤维形成，显示出恢复新组织的显著速度。此外，体外细胞共培养和体内动物实验均显示，LCS发挥了诱导巨噬细胞分化以促进胶原合成的能力。这项工作为基于这种独特的层状多孔结构设计制备其他功能性、廉价和有效的组织移植替代物用于医学应用提出了新的见解。
全文链接：
https://doi.org/10.1002/adfm.202105348
原文刊载于【高分子科学前沿】公众号
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