摘要
本文作者以香叶醇为起始原料一锅酶法无细胞生物合成荆芥醇。具体为利用一对正交辅因子再生系统进行NAD+依赖性香叶醇氧化和随后的NADPH依赖性还原环化，并且无需分离中间体。正交辅因子再生系统保持高NAD+与NADH比率和低NADP+与NADPH比率，整个反应包含四种生物合成酶以及五种辅酶，最后作者将NAD+依赖性脱氢酶添加到一锅反应中以1 g/L规模制备猫薄荷—荆芥内酯。
内容
辅因子供应与再生是无细胞生物合成体系的挑战性难题之一，当前策略主要包括辅酶偏好改造、使用非天然辅因子、采取用于辅因子平衡的分子变阻器等。在涉及氧化还原反应系统中，辅因子的使用当量尤为重要。本文作者构建正交辅因子再生系统实现顺反荆芥醇的一锅法无细胞合成（图1）。
从香叶醇1生物合成荆芥醇6需要NAD+依赖性氧化和NADPH依赖性还原环化（图2）。TfG8H首先进行羟基化，GOR和过量的NAD+反应时氧化生成3-5，由于辅因子的消耗和反应可逆性，反应在这四种化合物之间达到平衡。随后将5与ISY和MLPL共同孵育后，使用过量的NADPH生成荆芥醇6。
使用亚化学计量量的辅助因子从1中一锅法合成6具有挑战性。首先，需要正交辅因子再生系统从NADH（GOR氧化步骤）再生NAD+，同时不氧化NADPH（TfG8H和ISY所需的辅因子）。同时辅因子再生系统也需从NADP+再生NADPH，同时不将NAD+还原为NADH。其次再生系统酶活性需适配TfG8H、GOR和ISY的不同反应。对于可以选择性氧化NADH而不是NADPH的氧化酶，作者使用来自乳酸乳球菌的NADH氧化酶(NoxE)。结合辅因子正交性、酶表达简易性和成本效益，作者构建延胡索酸水合酶(FumC)和NADP+依赖性苹果酸酶(MaeB)组成的双酶系统用于选择性还原NADP+。
借助以上构建的正交辅因子再生系统，作者尝试使用所有纯化的酶进行一锅酶法合成荆芥醇6。9种酶与1一起孵育生成多种分流产物。尽管产生了5，但同时生成大量的香茅醇9和8-羟基香茅醇10。为减少9的形成，作者使用了多步一锅法以93%收率生成荆芥内酯（图3A,迹线vi）。为探测一锅反应与作用于6的下游生物合成酶的相容性，引入NAD+偏好的SDRNEPS1最终几乎完全转化生成7（图3A,迹线vii）。
总之，该反应利用五种生物合成酶和五种辅酶，并使用一对正交辅因子再生酶从香叶醇一锅酶法制备荆芥内酯。该系统生产荆芥内酯的滴度比微生物平台中报道的最高滴度高130倍，为单萜吲哚生物碱天然产物的生物合成提供参考。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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