2021-06-16，Science Advances (IF=14)上发表，将光敏色素分子表达在AAV表面，形成OptoAAV，可实现光控诱导的AAV病毒基因转导，在时空维度下进行单细胞基因工程改造。
通讯作者是Wilfried Weber教授，来自德国的University of Freiburg（弗莱堡大学）。
背景
本文报道了一种新的、基于光控的、病毒载体基因转导方法。设计了一种新型的基于光学调控的腺相关病毒载体系统（OptoAAV），可以实现精准的单细胞水平时空基因转导。
AAV载体是一种无包膜的单链DNA病毒载体，既可转导分裂细胞，也可转导非分裂细胞，且具有很好的安全性。OptoAAV 技术只需借助短时间的低强度红光，即可实现对区域细胞或单细胞的动态基因转导，具有高通量的应用潜力。
内容简介
1OptoAAV系统的设计原理
首先，是AAV病毒载体的改造，使其对天然细胞受体（硫酸乙酰肝素蛋白多糖，HSPG）失去靶向能力，并将拟南芥的光敏色素相互作用因子6（PIF6）表达在病毒衣壳表面。
其次，重组表达具有细胞靶向的接头融合蛋白（PhyB-DARPin），其中DARPin能够靶向细胞，而PhyB是拟南芥的光敏色素 B，红光（660 nm）照射下，接头蛋白的PhyB 可与OptoAAV表面的 PIF6 相互作用，将OptoAAV 靶向到细胞表面（通过DARPin靶向作用），从而实现靶细胞的基因转导。
其三，用远红光（740 nm）照射，可使解离PhyB与PIF6的相互作用，从而阻止病毒转导的发生。
图1：光控病毒转导的设计原理
2OptoAAV系统的表征
作者选择高表达EGFR的人表皮鳞状细胞癌细胞A431，将拟南芥的光敏色素相互作用因子6（PIF6）标记上黄色荧光蛋白mVenus（即mVenus-PIF6），重组表达了能靶向EGFR的接头蛋白（PhyB-DARPin EGFR）。
将荧光标记的光敏分子mVenus-PIF6、及接头蛋白（PhyB-DARPin EGFR）与高表达EGFR的A431细胞共孵育，通过流式细胞术分析，检测到了A431细胞表面的荧光信号，从而证明了OptoAAV系统的特异性靶向能力（图2A）。
为了在 AAV2的衣壳上展示光敏分子PIF6，将 PIF6基因融合到病毒衣壳蛋白VP2的N末端，由CMV强启动子控制。
另外，为了消除AAV2对天然细胞受体HSPG的亲和力，在cap基因中插入了R585A / R588A突变。并将绿色荧光蛋白GFP基因包装到OptoAAV中，作为病毒转导模型（图2B）。
HEK293T细胞中表达的OptoAAV，通过WB实验得到验证，PIF6-VP2在OptoAAV中成功表达（图2C）。
为了验证OptoAAV与PhyB的光控相互作用，将OptoAAV与PhyB连接的琼脂糖微球在660nm光下孵育，通过WB实验证明，OptoAAV 载体能与PhyB微球于光照下结合（图2D）。
图2：OptoAAV系统的元件及表征
3OptoAAV系统-时空控制的病毒转导
A431细胞与50 nM PhyB-DARPinEGFR 在PBS(含10% FCS)中于740 nm 光下孵育 10 分钟。
洗涤后，加入OptoAAVGFP（MOI：1.7 × 104）（PBS，含10% FCS），用 660 nm 光（15 μmol m-2 s-1）从底部照射细胞 9 秒，同时从顶部进行全局740 nm 照明（3 μmol m-2 s-1）， 在黑暗中孵育 2 小时。
在 740 nm 光下洗涤细胞并在培养基中孵育 46 小时。
最后，细胞被固定，DAPI 染色，并通过共聚焦显微镜成像。
另外，在 740 nm 光下洗涤细胞后，可回到第一步，用第二种OptoAAVmScarlet转导，可实现OptoAAV转导的光学时空调控。
图3：OptoAAV病毒转导 流程图
总结点评
作者开发了一种光敏型基因转导系统OptoAAV，创新地将拟南芥的光敏色素因子引入到 AAV表面，实现了单细胞分辨率的时空动态、多基因靶向转导，有效解决脱靶效应，对单细胞基因编辑或细胞药物的开发提供了重要思路。
原文刊载于【药学前沿进展】公众号
本文版权归原作者所有，文章内容不代表平台观点或立场。如有关于文章内容、版权或其他问题请与我方联系，我方将在核实情况后对相关内容做删除或保留处理！