在早期有丝分裂中，复制后的染色体由环形的粘连蛋白复合物（cohesin complex）连接在一起。在有丝分裂后期分离酶（separase，一种半胱氨酸蛋白酶）通过切割粘连蛋白复合物的SCC1亚基（也称为 RAD21）触发姐妹染色单体的分离。准确及时的染色体分离对于维持基因组稳定性以及防止非整倍体和肿瘤发生至关重要。
因此，在细胞进入分裂后期之前，通过与三种抑制因子securin、CDK1-cyclin B激酶或shugoshin2-MAD2（SGO2-MAD2）复合物结合，人源separase活性受到严格调控（抑制）。在向分裂后期过渡时，separase活性的激活主要通过两条途径：一是securin和cyclin B被泛素连接酶APC/C（Anaphase-promoting complex/Cyclosome）泛素化后降解进而激活separase活性；二是TRIP13与MAD2的特异性适配因子p31comet协同作用将separase从SGO2-MAD2复合物中释放出来。
目前为止，separase活性的抑制机制研究主要在集中在生化和细胞层面上；在结构研究方面虽有酵母和线虫separase-securin复合物的结构被报道，但是这些抑制因子结合并调控人源separase活性的具体分子机制一直是个谜。
2021年7月21日，瑞士日内瓦大学Andreas Boland团队（第一作者为余俊）在Nature期刊发表了题为：Structural basis of human separase regulation by securin and CDK1–cyclin B1研究论文。
该研究首次报道了人源separase与抑制因子securin或CDK1-cyclin B1-CKS1（CCC）激酶复合物的高分辨率冷冻电镜结构，揭开了securin，特别是CDK1-cyclin B1调控人源separase活性的分子机制，此外首次发现了cyclin B1上保守的磷酸基团结合口袋并同时揭示了separase抑制CCC激酶活性的分子机理。
为了更好的理解securin和CDK1-cyclin B1-CKS1（CCC）复合物抑制人源separase活性的机制，研究团队利用冷冻电镜分别解析了separase-securin（2.9Å）和separase-CCC（3.6Å）复合物的结构。与separase-securin复合物样品制备不同，重构separase-CCC复合物时，为了获得可溶性separase，其N段融合了securin的C段约四十个氨基酸残基；与此同时separase与CCC稳定结合依赖于ATP（separase的Ser1126 位点需要先被磷酸化）。
人源separase由HEAT-repeat结构域，TPR-like 结构域和蛋白酶结构域构成，其中TPR-like结构域含有两个很长的无序片段（insert 1 和insert 2），对于separase活性调节起到重要作用。除了HEAT-repeat结构域外，人源separase整体结构与酵母或线虫的比较相似。Securin以反平行的方式结合separase的所有结构域，而CCC主要结合TPR-like结构域和蛋白酶结构域。
Separase-securin和separase-CCC复合物的整体结构
结构分析表明，在这两种抑制复合物中，保守的假底物基序（pseudosubstrate motifs）结合在separase活性中心以及附近的对接位点，阻断底物的结合，从而抑制separase的活性。这些假底物基序包括EIEXXΦ motif（Φ代表疏水残基，X代表任意残基，下同），NXLXΦE motif以及LPE motif，它们同时也存在于底物SCC1中。
人源securin 与线虫或酵母的类似，自身序列包含了这三种假底物基序，表明从酵母到人securin调节separase活性的机制高度保守。然而，CCC序列中不包含以上任何一种假底物基序，那么它又是如何抑制separase活性的呢？原来当CCC结合separase后，来自separase自身原本无序的片段形成特定的结构结合其活性中心及附近区域，从而抑制自身活性。
研究人员称它们为自抑制loops（autoinhibitory loops, 包括AIL1，AIL2和AIL3），其中AIL1 包含NXLXΦE motif，形成一个小a螺旋结合separase活性中心附近区域， AIL3（位于insert 2）包含“NFS”序列以模拟EIEXXΦ motif结合separase活性中心，值得一提的是，虽然“NFS”序列结合separase的方式与EIEXXΦ motif的相似，但主链方向是相反的。
自抑制loops（AIL1-3）与securin结合separase的结构比较
除了自抑制loops外，原本无序的insert 1在separase-CCC复合物中也形成有序的结构，缠绕在cyclin B1上。特别地，insert 1中的Ser1126 位点被磷酸化后结合cyclin B1上一个保守的磷酸基团结合口袋（据研究人员所知，这是首次在cyclin B1上发现的磷酸基团结合口袋）。此外，之前大量研究表明，CCC结合separase后，其激酶活性也受到抑制，那么其中的机制又是怎样的呢？在separase-CCC复合物中研究人员发现AIL3中的CDC6-like结构域，结合在CDK1的活性中心并占据了底物结合位点；最重要的是其中保守的 APXXXXR motif类似于CDK底物的磷酸化位点（SPXR），作为假底物抑制CDK1的活性。
cyclin B1磷酸基团结合位点及separase抑制CDK1的活性结构基础
综上，本研究首次解析了人源separase结合securin或CCC的冷冻电镜结构，阐述了securin和CDK1-cyclin B1以不同的机制结合并抑制separase的活性。Securin含有三个假底物基序，结合separase活性中心以及附近的对接位点，阻断底物的结合，从而抑制separase的活性。然而，在separase-CCC复合物中这些假底物基序来自separase自身。此外，本研究首次发现了cyclin B1上保守的磷酸基团结合位点，并揭示了separase也是依赖假底物基序来抑制CDK1活性的分子机制。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03764-0
原文刊载于【生物世界】公众号
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