摘要
植物油中的不饱和脂肪酸对人体健康具有重要作用，而其中的反式脂肪酸是油脂或食物中不受欢迎的成分，对人体有显著的副作用，包括诱发心脏病或代谢紊乱等。世界卫生组织建议每天来自反式脂肪酸的热量不超过食物总热量的1%；美国FDA和我国卫生监管机构都规定，食品的营养标签必须标明反式脂肪酸的含量。因此，如何从不饱和脂肪酸中选择性地去除反式脂肪酸，既是一个重要的食品安全问题，也是一个富有研究意义的重要课题。最近，浙江大学吴起教授和浙江工业大学徐鉴教授团队首次利用工程化改造光敏脂肪酸脱羧酶（Fatty acid photodecarboxylase fromChlorella variabilisNC64A，CvFAP）催化的脱羧反应，选择性催化反式脂肪酸的脱羧，生成易脱除的碳氢化合物和二氧化碳，而顺式脂肪酸保持不变。采用FRISM策略进行蛋白质工程改造，增强氨基酸残基与底物双键之间的电子相互作用，稳定了游离酸在通道中的结合。在模型底物中，最佳突变体V453E的反油酸/油酸的选择性（ToC）比野生型（WT）提高了1000倍。作为反式脂肪酸直接生物催化脱羧技术的首次报道，本研究为不含有反式脂肪酸的高质量食用油的生产提供了可能。
内容
在食品加工业中，生物催化由于其绿色、环保、无毒的特性，成为一项具有吸引力的技术。然而利用生物催化实现反式脂肪酸去除的报道中，所有例子都是利用脂肪酶对脂肪酸的酯化或者水解反应来实现反式脂肪酸的拆分。本文作者利用CvFAP实现了直接从不同种类的脂肪酸混合物中选择性地消除反式脂肪酸（图1）。
图1酶催化反/顺式脂肪酸的选择性反应
由于油酸和反油酸具有相似的物理性质，且在植物油中经常出现，因此选择油酸和反油酸作为模型底物。考虑到底物在酶催化过程中的低溶解性问题，作者首先引入不同的助溶剂，从而筛选出反应活性和反式/顺式脂肪酸选择性（ToC）都较好的甲醇助溶剂（图2）。
图2 WT-CvFAP催化模型反应的助溶剂筛选
随后，作者利用分子对接，采用“聚焦理性迭代定点突变”（“Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis”（FRISM））定向进化策略，对来源于小球藻（Chlorella variabilis）NC64A的光敏脂肪酸脱羧酶（CvFAP）进行蛋白质工程改造。考虑到底物双键的尺寸较小，结合口袋的空间结构性质可能不是影响顺反式异构体选择性的关键因素。因此，选择富电子氨基酸Ser、Asp、Glu和Phe作为突变，以诱导双键与残基之间可能形成p-π或π-π堆叠作用，从而进一步分离两种异构体。在底物双键5Å范围的氨基酸残基（T484，Y466，T465，A457，G455和V453）上构建FRISM小型突变库，结果如图3所示。其中突变株G455D和V453D与野生型CvFAP相比，其反式/顺式选择性（ToC）提高了70-90倍。而突变株V453E的ToC值更是高达1000，可以实现反油酸脱羧消耗接近99%时，油酸完全不发生脱羧反应。
图3利用FRISM策略在选择的位点引入富电子氨基酸突变（F/E/D/S）的筛选结果
通过动力学和热稳定性测试，V453E突变体都具有较好的性质。利用该突变体，作者评估了其对其他脂肪酸的催化性能。V453E突变体对异油酸和顺式异油酸、反式亚油酸和亚油酸也都表现出较好的反式选择性，ToC分别达到7.5和170（表1）。在此基础上，作者将油酸和反油酸两种底物配制成不同比例的混合样品，其中，V453E对50：50的混合样的ToC可达95：5；而对于更加接近植物油（PHVO）比例的95：5的混合样品，V453E的ToC也可达到92：8。最后，作者利用五种脂肪酸配制出更加接近真实植物油比例的模拟样品，在V453E催化下，反油酸基本完全消耗，而油酸底物只有9%左右的消耗（图4）。表1 WT-CvFAP和V453E催化不同脂肪酸的反应活性
图4 V453E催化PHVO模拟物的转化
最后，作者利用分子动力学模拟，揭示了突变体V453E的高反式选择性的原因。从图5所示的代表性结构来看，反油酸中氧原子与FAD中N5原子之间的最小距离小于油酸（5.5 Å-反油酸，6.2 Å-油酸），而另一个明显的差异表现在底物双键区域，富电子氨基酸453E和466Y在反油酸双键周围堆积，导致多个p-π或π-π相互作用，稳定了该通道中反油酸的结合，而油酸双键与453E和466Y之间的距离较长（图5），油酸结合到底物通道时，这种相互作用大大减弱，从而影响了底物活性。此外，作者还计算了油酸和反油酸与V453E的结合能，结果与预期一致。反油酸底物具有更低的结合能（-63.50 ±0.53 kcal·mol–1-反油酸，-37.09 ±1.07 kcal·mol–1-油酸），表明反油酸易于被V453E接受。接下来，作者进行了荧光动力学测试，以进一步研究顺反异构体的选择性机制。对于含有反油酸的V453E突变体，1FAD*荧光猝灭的动力学几乎与含有反油酸的WT相同（即~300 ps），而在含有油酸底物的V453E突变体中，1FAD*荧光以单相衰减，时间常数为~3ns，缺乏快速衰变，表明没有有效的电子转移过程。此外，根据自由基捕获实验的LC-MS结果，还观察到反油酸的TEMPO产物。相比之下，没有检测到油酸的相应TEMPO产物。这些结果揭示了最佳突变体V453E对顺反异构体活性差异显著的来源。
图5 V453E和底物油酸（a）、反油酸（b）的动力学模拟示意图
本研究为食品安全领域防止反式脂肪酸的过量摄入提供了有价值的方案。相关研究结果已发表在国际期刊《Angewandte Chemie International Edition》上。研究工作得到国家重点研发计划，国家自然科学基金等项目资助。浙江大学博士研究生李丹阳是该论文的第一作者，浙江大学吴起教授和浙江工业大学徐鉴教授为该论文的共同通讯作者。
招聘
吴起课题组长期招聘博士后，研究方向：1）酶定向进化；2）合成生物学；3）手性生物催化。待遇按浙江大学博士后相关规定执行，此外还享受浙江大学前瞻化学中心的资助，起薪税前30-40万（包括基本薪酬25万，考核奖金5-15万）。感兴趣的可以请将个人简历及必要的支持材料发送至wuqi1000@163.com，（课题组网站：https://person.zju.edu.cn/0003155）。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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