摘要
含过氧桥键类天然产物具有独特杂环结构。NvfI催化novofumigatonin生物合成途径中含过氧桥键中间体fumigatonoid A的形成。本文作者对NvfI进行结构和功能分析，NvfI通过动态构象变化使底物自由基中间体在活性位点重新定位并引入三个氧原子。基于以上结果，作者提出NvfI催化的独特过氧桥键形成机制。
内容
过氧桥键具有独特杂环结构，存在于萜类、生物碱类、聚酮类和杂萜类等天然产物中。目前主要有环氧合酶COX和Fe(Ⅱ)/α-KG依赖型双加氧酶FtmOx1两种类型酶催化过氧桥键的形成，其机理如Fig. S1所示，催化残基Tyr分别作为COX中的氢原子转移中间体和FtmOx1中的氢原子供体发挥关键作用。
在前期研究中，作者解析novofumigatonin的生物合成途径及相关关键酶的催化机理。
Nat Comm9.1 (2018): 1-10.
其中Fe(Ⅱ)/α-KG依赖型酶NvfI催化2并引入三个氧原子（过氧桥键和C-3'-羟基）生成1（图1）。
NvfI体外酶学实验NvfI与2体外酶学反应产生1及其异构体3（图2a）。为确定α-KG和2的化学计量，在有氧条件下使用不同比例的两种底物进行反应，当两者比例约为1:1时，2几乎被完全消耗，表明在1的形成过程中消耗1当量的α-KG（图2b）。另一方面，使用不同量的氧气以测量氧的化学计量，结果显示1的产量随氧气浓度增加而增加，并在比率约为2时达到稳定，表明引入三个氧原子需要两倍当量的氧气。
接下来作者分析1中氧原子的来源，使用18O2和H218O进行标记实验，在一个反应循环中1中应新引入三个氧原子，但结果表明至多引入四个氧原子，两个来自氧气，两个来自溶剂水（图2c-g）。作者推测过氧桥键部分的氧来源于氧气，C-4'处的羰基氧通过半缩酮中间体和C-3'羟基氧来源于溶剂水。
NvfI结构分析作者解析以单体形态存在的NvfI晶体结构。NvfI具有Fe(Ⅱ)/α-KG依赖型加氧酶典型的DSBH折叠结构特征（图3）。
NvfI活性中心NvfI的活性位点位于DSBH核心结构域，Fe由His135-His137-Asp250三联体锚定（图3d、e）。作者对比具有α-KG（单体B，State I）的二元复合物结构与具有2和α-KG（单体A，State III）的三元复合物，loop I的Ser122-Gly128和loop II的Trp199-Pro209在底物结合后发生显著的构象变化（图3、4）。此外，作者解析与α-KG类似物NOG结合的NvfI复合物（单体B，State II）结构。
底物结合模式底物2的结合模式如图5所示。
NvfI突变实验loop I和loop II中的Phe127和Trp199经历显著的构象变化，可能作为门控残基将底物上载到活性位点，此外loop II中Glu208翻转为结合2的A环部分减少位阻（图3）。作者构建Phe127、Trp199和Glu208突变体（图5c和6）。用Ala取代Phe127和Trp199酶活性消失，而E208A变体提高活性。以上表明大位阻芳环Phe127和Trp199将底物自由基转移至Glu208，从而阻止C-13位的羟基化。
Tyr残基在COX和FtmOx1相关反应中发挥关键的催化作用，而在NvfI中只有Tyr116位于活性位点，作者将其突变为Ala和Phe发现突变体仍有活性，表明Tyr116不参与NvfI的催化机制。为鉴定催化残基，作者将位于2周围残基Ser114、His138和Arg201等进行突变，结果表明NvfI不利用活性位点残基介导氢原子转移。
过氧桥键可以通过光敏剂吸收光产生单线态氧的非酶促反应形成（例如抗疟药物青蒿素）。此外，在先前提出的COX和FtmOx1中酶促形成过氧桥键机制中，活性位点Tyr为主要催化残基。然而本文中NvfI不利用任何活性位点残基生成自由基中间体。作者可以提出几种可能的反应途径（Fig. S13）。
基于结构和功能分析，作者提出NvfI催化过氧桥键形成机理如图7所示。
总之，本文作者通过对NvfI的结构功能分析表明其独特的过氧桥键形成机制，NvfI通过动态构象变化使底物自由基中间体在活性位点重新定位，从而避免羟基化副反应，为未来研究相关过氧桥键生物合成机制提供参考。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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