摘要
德国Greifswald大学Uwe Bornscheuer教授课题组在Angewandte Chemie杂志发表Hot论文Discovery of Novel Bacterial Chalcone Isomerases by a Sequence–Structure–Function–Evolution Strategy for Enzymatic Synthesis of (S)-Flavanones。挖掘细菌来源的查尔酮异构酶并用于酶促合成(S)-黄烷酮。
内容
黄酮是一大类主要来自植物的次级代谢产物。黄酮类化合物在植物中具有多种生理功能，并对人类具有有益的药理特性，是天然产物生物合成研究中热点目标产物之一。植物中黄酮类化合物的骨架合成途径中，查尔酮异构酶(CHI)环化查尔酮生成(S)-柚皮素，而后者是黄酮类化合物多样化的中心中间体之一（图示1）。作为黄酮类化合物天然合成途径中的关键酶之一，植物CHI的催化机制、蛋白质结构、分类和进化方面已经得到广泛和深入的研究。
由于黄酮类化合物有抑菌作用，部分微生物在进化中已经获得了黄酮降解途径。该课题组在2014年就首次鉴定出来源于Eubacterium ramulus的CHI。但是在之后的很长时间内，没有更多的细菌来源的CHI报道。在新的研究中，作者使用序列-结构-功能-进化的研究策略，获得了66个全新的具有不同底物选择性的细菌CHI，并通过进化树和蛋白结构分析，获得了活力显著提高的突变体（图1）。
作者通过多种搜索策略检索NCBI数据库，获得88条CHI相关序列。进化树分析显示，这些序列可以分为两大分支。蛋白结构模拟分析显示，A分支的蛋白结构和细菌CHI高度相似，但是B分支蛋白的催化域结构发生了很大变化，并不具备CHI活性。因此，A分支上的66个蛋白是潜在的细菌CHI。作者接着分析了底物结合口袋，发现和柚皮素B环结合的口袋具有多样性。这显示这些潜在的细菌CHI可能具有不同的底物选择性（图2）。因此，作者选择进化树上每个小分支的特征序列，合成了13条蛋白基因，表达和活性测定显示这些蛋白均有CHI活性，并对不同结构的查尔酮显示不同的底物选择性。作者又分析底物口袋多样性，设计了12个突变体，获得的突变体对不同结构的查尔酮底物的活性显著增强（图3）。
植物来源的CHI均为(S)-立体选择性，生成有生物活性的(S)-黄酮烷。但是，细菌来源的CHI的立体选择性尚未被揭示。因此，作者测定了细菌CHI对不同结构查尔酮的立体选择性。发现这些酶对柚皮素查尔酮和橙皮素查尔酮有严格的S-立体选择性，产物光学纯度达到96% ee。由于查尔酮在水溶液中会快速环化生成外消旋的黄酮烷，所以细菌CHI实际的立体选择性比测定值更为严格。作者使用细菌CHI合成了不同结构的黄酮烷并鉴定了结构，收率达到100%（图示2）。
植物来源的蛋白在原核细胞中表达存在一定困难，这给在异源细胞中合成植物来源的天然产物带来障碍。用微生物来源的同工酶替代植物来源的酶是解决这一问题的一条途径。作者发现的细菌来源的具有严格(S)-立体选择性和不同底物选择性的查尔酮异构酶为黄酮类化合物的异源和体外酶促合成带来新的酶工具盒，对构建人工细胞工厂生产黄酮类化合物具有重要意义。该项目由Bornscheuer教授课题组和德国Symrise公司合作完成，获得欧盟Horizon2020项目资助。奕栋博士为共同通讯作者和共同第一作者。奕栋博士现任上海医药工业研究院生物制药部研究员、研发主管、学术带头人。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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