摘 要
在分子中引入氘原子在代谢组学、医学成像以及合成化学中的机理研究等方面都有重要应用。特别是在药物化学中，由于C-D键的化学键能比C-H键高，C-D键的引入能有效的调整药物分子的吸收、分布和毒理学性质，因此近年来氘代药物技术已经成为新药研发的一个重要途径。2017年，氘代丁苯那嗪获得FDA批准上市，更是极大地促进了氘代药物的发展。
传统的氘代方法通常依赖于化学催化。生物催化具有反应绿色、高效以及高选择性等优点，因此在合成化学领域得到了越来越多的应用。然而，到目前为止，生物催化氘代的方法还报道很少，仅有醇脱氢酶催化的生物还原氘代和芳香族L-氨基酸脱羧酶催化的芳香族氨基酸脱羧氘代等少数几种方法，但是分别存在需要化学计量的氘代辅酶、底物谱很窄等问题。最近，浙江大学吴起教授和浙江工业大学徐鉴教授课题组报道了一种光敏脂肪酸脱羧酶催化合成氘代烷烃的新方法。他们利用近期发展的聚焦理性迭代定点突变（“Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis” (FRISM)，见J. Am. Chem. Soc. 2019, 141,7934–7945）的策略，通过多样性的定向进化路线，对来源于小球藻（Chlorella variabilis）NC64A的脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）进行蛋白质工程改造，显著提升了该酶对长链、中链、短链、手性、含有芳香环的大体积等多种羧酸的脱羧反应活性，在采用重水作为反应溶剂和廉价氘源的情况下成功实现了多种不同类型羧酸的脱羧氘代反应，以较高产率和氘代率合成了多系列氘代化合物。
研究内容
近日国际权威期刊《Nature Communication》在线发表了来自浙江大学化学系吴起课题组的研究论文“Light-driven decarboxylative deuteration enabled by a divergently engineered photodecarboxylase”（Nat. Commun. 2021, 12, 3983, https://doi.org/10.1038/s41467-021-24259-6）。该文中作者首先采用野生型CvFAP催化活性较好的十六酸作为模型底物测试氘代反应的可行性，获得了良好的产率和氘代率。值得注意的是，区别于传统的化学脱羧氘代过程，该反应可以在空气氛围中进行。
表1、脱羧氘代反应条件优化
图1、氘代底物谱：长链脂肪酸底物
作者利用野生型CvFAP催化了一系列长链脂肪酸的脱羧氘代反应，均得到了较好的产率和氘代率（图1）。然而，在对这一反应进行底物扩展的研究中，作者发现由于CvFAP底物结合口袋狭长，因此其对于中链、短链、大体积环状羧酸底物的催化活性都大大下降，需要对该酶进行蛋白质工程改造以适配多样性的底物结构。作者利用FRISM策略，选择了一些关键的氨基酸位点（图2），分别采用A/L/F的突变，构建突变库，筛选后发现突变株I398L对中链酸（壬酸）具有较高的活性，相同时间的产率从WT的18%提高到100%（图3b）。利用I398L突变株合成了一系列中链羧酸的氘代烷烃产物（图4）。然而该突变株和WT一样对短链羧酸的催化活性很低，因此利用丙酸对突变库进行筛选，获得了G462A的突变株，该突变株可以将丙酸的脱羧氘代产率从3%（WT）提高到80%（图3c），同样利用该突变株合成了一系列短链羧酸的氘代烷烃产物（图5）。
此外，如果能利用酶的空腔对脱羧氘代反应进行拆分，一步构建手性氘代化合物显然具有重要的应用价值。因此，作者通过利用手性羧酸4A进行突变库筛选，获得了一对具有立体选择性互补的突变株，其中I398R和G462F分别对R-构型的羧酸和S-构型的羧酸具有优先的反应活性和选择性，从而可以实现手性氘代产物的制备。作者进一步考察了I398R催化外消旋羧酸的R-构型脱羧氘代反应的底物谱，获得了一系列手性氘代产物（图6）。前期研究发现CvFAP对含有芳环的大体积羧酸的催化活性很低，作者以3-苯基丁酸作为底物，经过筛选后同样获得了具有较高活性的突变株Y466A，底物扩展研究表明该突变株也具有较宽广的底物谱（图7）。
最后，作者还通过分子动力学模拟对各种底物的最佳突变株与相应底物的结合情况，以及其活性提升的分子机制进行了探讨，进一步认识了不同突变株与其最适底物之间的构效关系和选择性机理（图8）。
图2、CvFAP催化空腔中的关键氨基酸位点
图3、CvFAP多样性的定向进化扩展脱羧氘代反应底物谱
图4、氘代底物谱：中链脂肪酸底物
图5、氘代底物谱：短链脂肪酸底物
图6、氘代底物谱：手性脂肪酸底物
图7、氘代底物谱：含芳环大体积羧酸底物
图8、各类底物在CvFAP催化口袋结合状态的分子动力学模拟
总 结
该研究建立了新型的光脱羧酶CvFAP催化氘代反应新方法，为新药研发、合成化学及生命科学研究领域提供了更好的酶催化剂，对酶催化应用的拓展具有重要意义。这一成果的通讯作者为浙江大学化学系吴起教授、浙江工业大学生工学院徐鉴教授（本课题组毕业生），徐鉴、范嘉杰、楼玉姣、徐维华、王志国为共同第一作者。该工作得到国家自然科学基金委项目和国家重点研发项目的支持。
Jian Xu, Jiajie Fan, Yujiao Lou, Weihua Xu, Zhiguo Wang, Danyang Li, Haonan Zhou, Xianfu Lin & Qi Wu, Light-driven decarboxylative deuteration enabled by a divergently engineered photodecarboxylase, Nature Comm., 2021, 12, 3983.
https://doi.org/10.1038/s41467-021-24259-6
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