摘要
酶的催化混杂性探究是一个长期的挑战和研究热点。丛志奇课题组先前已成功构建了双功能小分子(DFSM)激活P450过加氧酶活性的催化策略（详见往期推荐1）。然而，DFSM促进的P450-H2O2系统显示出有限的过氧化物酶活性。基于对可能的竞争性氧化途径的机理分析，本文利用替换氧化还原敏感残基的蛋白质工程赋予DFSM促进的P450-H2O2系统高效的过氧化物酶活性，该系统可高效催化愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚、邻苯二胺和对苯二胺等底物的一电子氧化，并获得了迄今为止已知P450的最佳过氧化物酶活性，催化性能可媲美或超过大多数天然过氧化物酶。本研究结合蛋白质工程和外源DFSM分子的协同作用，为P450催化混杂性研究提供了新颖的见解和策略。
内容
细胞色素P450酶是一类含血红素的氧化还原酶，在生物合成和有机合成领域有着巨大的应用潜力。然而绝大多数P450酶催化功能的实现高度依赖还原辅酶NAD(P)H以及复杂的电子传递链协助活化分子氧，这在一定程度上限制了P450酶的实际应用。丛志奇研究组已成功构建双功能小分子（DFSM）协同P450催化的人工过加氧酶系统（Figure 1A），能够直接利用过氧化氢作为末端氧化剂，解除P450酶对辅酶体系依赖的同时极大提高了P450BM3对苯乙烯、乙苯和苯甲硫醚等非天然底物的催化活性（Figure 1B）。然而，该系统催化愈创木酚主要生成去甲基化产物邻苯二酚，愈创木酚是过氧化物酶的经典底物，这表明DFSM促进的P450BM3-H2O2系统主要发挥过加氧酶而不是过氧化物酶的作用（Figure 1C）。
Figure 1. (A) Proposed mechanism for catalytic activation of H2O2in the DFSM-facilitated P450BM3-H2O2system; (B) its peroxygenase reactivity; and (C) the strategy applied in this study based on engineering redox-sensitive residues to switch peroxygenase activity to peroxidase activity. DFSM: Im-C6-Phe =N-(ω-imidazol-1-yl hexanoyl)-L-phenylalanine or Im-C5-Phe =N-(ω-imidazol-1-yl pentanoyl)-L-phenylalanine.
过氧化物酶是一类重要的氧化还原酶，在生物催化、生物传感器和生物医学领域有着广泛的应用。与P450中单加氧酶和过加氧酶的研究相比，对P450过氧化物酶活性的研究仍然相对较少。将DFSM促进的P450BM3-H2O2系统的过加氧酶转换为过氧化物酶可进一步扩大P450的化学催化范围和应用。目前，人们普遍认为Compound I(Cpd I)，即FeIV=O复合物，主要负责含血红素氧化酶中底物的氧化。Cpd I与底物之间的相对位置(或距离)可决定血红素酶的表观功能，即发挥过加氧酶或过氧化物酶的功能。我们推测DFSM促进的P450BM3-H2O2系统氧化愈创木酚主要有三种可能的催化途径（Figure 2），当愈创木酚远离Compound I时，氧化还原敏感残基的竞争性氧化（Path B）阻碍了愈创木酚的一电子氧化（Path C）。因而，本研究计划利用蛋白质工程策略改造氧化还原敏感残基进而增强DFSM促进的P450BM3-H2O2系统的过氧化物酶活性。
Figure 2. Proposed reaction pathways for the oxidation of guaiacol by the DFSM-facilitated P450BM3-H2O2system. Path A: hydroxylation of guaiacol at a suitable position (close to Cpd I) via H-abstraction; Path B: one-electron oxidation of redox-sensitive residue, such as tyrosine, through a long-range electron transfer (LRET) process; Path C: one-electron oxidation of guaiacol at a remote position (far from Cpd I) via LRET.
基于替换氧化还原敏感残基的策略，首先将位于蛋白质表面的Y160突变为不易氧化还原敏感残基A、I、L、V、G，经愈创木酚氧化筛选确定最有益取代基为F87A/Y160I（TTN=149）；然后将P450BM3中其余氨酪酸残基分别突变为I，经筛选发现F87A/Y198I和F87A/Y256I具有更高活性的愈创木酚一电子氧化活性，TTN分别为249和317；其他氧化还原敏感残基W96、F405、M237的筛选发现仅F87A/M237I可提高愈创木酚的一电子氧化活性，TTN为465。最后，将有益取代基Y160I、Y198I、Y256I、M237I进行组合突变，进一步筛选发现最优突变体为F87A/Y160I/Y198I/M237I，其催化愈创木酚一电子氧化的TTN高达8838，是P450BM3-F87A的900倍，这是迄今为止已知P450酶催化愈创木酚氧化的最佳反应活性。GC和GC-MS产物分析表明愈创木酚氧化仅生成一电子氧化产物，上述结果均表明本研究已成功运用机制指导的蛋白质工程策略将双功能小分子激活的P450过加氧酶转换为过氧化物酶（Figure 3）。
Figure 3. (A) Distribution of tyrosine residues in P450BM3-F87A; (B) combinatory engineering targets in P450BM3 (PDB No. 1JPZ); (C) engineering of P450BM3 for one-electron guaiacol oxidation by the DFSM-facilitated P450BMA3-H2O2system.
另外，双功能小分子激活的P450过氧化物酶对其他一电子氧化底物如2,6-二甲氧基苯酚（DMP）、邻苯二胺（OPD）、对苯二胺（PPD）也具有优异的催化性能(Scheme1)，F87A/Y160I/Y198I/M237I催化DMP生成四甲氧基对苯醌，TTN高达8453；F87A/Y160I/Y198I催化OPD和PPD分别生成2，3-二氨基吩嗪和含双亚胺的三聚体，TTN分别高达32563和17408。
Scheme 1. Oxidation of 2,6-dimethoxyphenol,o-phenylenediamine, andp-phenylenediamine catalyzed by DFSM-facilitated P450BM3 peroxidase in the absence and presence of Im-C6-Phe.
P450BM3突变体催化不同底物一电子氧化的动力学参数分析表明DFSM促进的P450BM3-H2O2系统相对于已知的P450酶具有更为优异的过氧化物酶活性（Table 1）。如F87A/Y160I/Y198I/M237I催化愈创木酚一电子氧化的kcat/Km高达27902 M-1s-1，远高于嗜热P450 175A1突变体（~34倍）和一些天然过氧化物酶，例如细胞色素c过氧化物酶（~350倍）。
最后，为深入理解替换氧化还原敏感残基将P450过加氧酶转换为过氧化物酶的机制，本研究组与厦门大学王斌举教授合作进行了F87A和F87A/Y160I/Y198I/M237I在愈创木酚和DFSM存在下的MD模拟计算（Figure 4）。计算表明，氧化还原敏感残基在调节P450的过加氧酶或过氧化物酶活性中发挥关键作用，并且DFSM促进的P450-H2O2系统中过氧化物酶活性可能来源于消除氧化还原敏感残基的竞争性氧化或蛋白质工程后底物方向的改变。
Figure 4. (a) The distance fluctuation of O(Cpd I)-H in F87A and F87A/Y160I/Y198I/M237I; (b) The most populated active site structure from the clustering analysis of MD trajectories of F87A and F87A/Y160I/Y198I/M237I. For clarity, the active site structure is only displayed, while the protein environment is omitted; (c) DFT calculated Gibbs energy barrier (in kcal/mol) for DFSM-mediated PCET process to generate the substrate radical.
综上所述，本文利用机制指导的蛋白质工程策略将双功能小分子激活的P450过加氧酶成功转换为过氧化物酶，该系统实现了迄今为止已知P450酶的最佳过氧化物酶活性，也可与大多数天然过氧化物酶相媲美。这项研究证明了DFSM促进的P450BM3-H2O2系统的可塑性，并为调节P450s的催化混杂性提供了新颖的见解和策略。
中国科学院青岛生物能源与过程研究所马娜娜、厦门大学房文涵为论文的共同作者，丛志奇研究员和王斌举教授为论文的共同通讯作者。研究工作得到国家自然科学基金，青岛创新领军人才计划以及中国科学院生物燃料实验室等的支持。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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