【摘要】
氨基丙二酸(Aminomalonate,Ama)是谷氨酸和天冬氨酸的同系物，也是自然界广泛存在的一种代谢物或结构单元。Ama被发现存在于多种天然产物，同时，也作为延伸单元参与多种非核糖体肽/聚酮天然产物的生物合成。有意思的是，Ama被发现存在于细菌蛋白质组的碱水解液中，猜测Ama可以通过某种翻译后修饰的方式产生，然而这样一种核糖体起源迄今未知。
核糖体合成翻译后修饰的多肽类天然产物（RiPPs）为发现全新的多肽生物化学提供了机会。其中S-腺苷甲硫氨酸自由基酶（rSAM）是一类存在于多种RiPPs家族的后修饰酶，并参与催化了诸如C-C, C-O, C-S键形成等多种化学上较为困难的反应。在这些反应中，rSAM酶首先利用一个保守的[4Fe-4S]簇去还原均裂辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM），产生一个高度活泼的5’-脱氧腺苷（dAdo）自由基攫取底物氢原子，从而引发后续的反应。近日，复旦大学张琪课题组对一类新发现的RiPP修饰rSAM酶，即三残基环番成熟酶（3-CyFE），进行了详尽的体内体外鉴定，报道了此类酶具有高度的催化泛杂性，不仅能够催化底物FxS形成三残基环番，也能催化Ser氧化经中间体甲醛甘氨酸（FGly）形成Ama，阐明了Ama合成的第一种核糖体途径。
【内容】
RiPPs的生物合成开始于一条基因编码的前体肽（包括N端前导肽和C端核心肽），前者往往被修饰酶的RiPP识别元件（RRE）识别从而协助后者产生翻译后修饰。本文作者注意到与大多数RiPP后修饰中rSAM酶不同，3-CyFE并不具有RRE结构域，因此着手此类酶的体外活性鉴定。作者选择了一类底物基序为FxS的3-CyFE簇进行鉴定，通过前体肽和酶的共表达实验进行了底物-酶活性验证，证实了三残基环番（-2Da）产物1的产生。
在对3-CyFE酶进行了严格无氧的体外活性鉴定时，作者发现酶反应后的前体肽是一组具有-2 Da，+14 Da和+16 Da质量变化的混合物。Trypsin酶解合并LC-MS分析、化学衍生鉴定发现该-2 Da产物并不是三残基环番产物1，而是由底物Ser氧化所形成的FGly（产物2），而+16 Da则是产物2水合得到的偕二醇。对于+14 Da产物，通过细致的串级质谱分析、水解衍生和标准品比对实验，作者鉴定了由Ser氧化所形成的Ama残基。
随后，在H218O的体外酶反应实验，HR-MS清晰的显示两个18O能够被标记进入Ama的游离羧基中，由此验证了由3-CyFE所催化形成Ama的机制：底物Ser先被氧化为FGly, FGly水合并参与进一步的氧化产生Ama。
作者又通过生物信息学分析揭示，与已知RiPP修饰rSAM不同，3-CyFE是一类厌氧硫解酶成熟酶（anSME）的同源酶 (注：anSME催化了底物硫解酶活性残基Cys/Ser氧化为FGly)，并发现3-CyFE其起催化作用关键残基与anSME相同。
最后，作者又通过体内共表达实验探索了3-CyFE的底物谱，发现了此类酶的两个特性：1）环番形成途径和Ser氧化途径可以被分配给不同的底物序列，2）催化反应是前导肽不依赖的，这样的两个发现也为后续多肽和蛋白的结构衍生来实现化学多样性奠定了基础。
本文第一作者为复旦大学化学系二年级直博生马溯泽和二年级硕士生陈恒，通讯作者为复旦大学化学系张琪教授。该工作得到国家自然科学基金委项目和国家重点研发项目的支持。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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