在单分子水平上了解生物分子的结构动力学，对于人们提升对分子机制的认知是至关重要的。然而，目前，很少有技术可以捕捉亚纳米尺度和生理相关条件下的动态。原子力显微镜(AFM)，具有在生理缓冲液和环境温度以及压力下分析未标记单分子的优点，但其分辨率限制了对生物分子构象细节的评估。
在此，来自美国威尔康奈尔医学院的Simon Scheuring等研究者，提出了定位AFM (LAFM)，一种克服当前分辨率限制的技术。相关论文以题为“Localization atomic force microscopy”发表在最新一期Nature上。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03551-x
由于其结构的复杂性和动态特性，对生物分子的天然结构和行为的观察颇具挑战性。此外，生物分子可以采用多种交换构象态。由于低温电子显微镜(cryo-EM)和X射线晶体学的最新进展，蛋白质结构的测定进展迅速。然而，这些结构代表了晶体中分子的平均系综的静态快照和/或低温成像，而单个分子在生理温度下是高度动态的。与提供3D实体数据的低温电子显微镜相比，AFM仅限于表面分析。然而，AFM可在原生环境中对分子进行成像，比如：(i)在环境温度下；(ii)在环境压力下；(iii)在生理缓冲中；(iv)在膜(在膜蛋白的情况下)中。此外，AFM测量机制和液体细胞的开放性，使得其可在(v)缓冲交换、(vi)温度变化以及(vii)在图像采集期间力的变化等场景中应用。
高速AFM (HS-AFM)的另一个优点是，通过集成短悬臂梁和开发更快的扫描仪及反馈操作，可以获得单个生物分子前所未有的实时纳米地貌信息。虽然这在揭示蛋白质构象变化方面非常有效，但通常不可能解析蛋白质表面的亚分子结构特征，主要原因是AFM尖端的尺寸有限。对于通常用于成像生物样本的探针，z方向(地形)的分辨率约为1 Å，而x、y方向的横向分辨率约为1 nm，基本上受探针几何形状和探针-样本相互作用力的限制。当对较软的样品成像时，由于尖端和柔性蛋白质结构之间的接触面积增加，横向分辨率进一步降低。由于这些限制，生物样品的亚纳米横向分辨率仅被报道为二维(2D)晶体，并被证明是由于周期性尖端卷积效应高估。为了规避这些限制，人们提出了尖端反褶积算法，它可产生锐化的图像，但也可能引入人工干扰。
定位显微镜方法，也被称为超分辨荧光显微镜，如随机光学重建显微镜(STORM)和光激活定位显微镜(PALM)，已经提供了对细胞的结构和大分子组装的细节洞察。通过在多幅图像中分离和定位高空间精度的激发荧光信号源，可以重建高横向分辨率的地图，将由光的衍射极限所设定的~400 nm分辨率限制降低到约20 nm。
在此，研究者受以上荧光定位显微镜方法的启发，开发了LAFM，将定位算法应用于AFM和HS-AFM图像中形貌特征的空间波动。与X射线结构和分子动力学(MD)模拟的比较表明，这种方法可以揭示埃米范围内的高分辨率蛋白质表面细节。通过对高速AFM和传统AFM数据中峰值位置的图像重建算法，提高了超出尖端半径限制的分辨率，并在自然和动态条件下对软蛋白表面的单个氨基酸残基进行了解析。LAFM可以通过长时间获得的多个分子图像或单个分子的多幅图像计算高分辨率地图，促进了单分子结构分析。因此，LAFM是一种可应用于任何生物分子AFM数据集的采集后图像重建的方法。
图1 LAFM原理。
图2 AqpZ和A5的LAFM。
图3 CLC-ec1的HS-AFM成像和LAFM工作流程。
图4 在中性和酸性pH值下CLC-ec1的构象变化。
综上所述，LAFM将成为应用于AFM成像的标准方法，允许提取高分辨率信息，超出了尖端半径分辨率限制，可用于原生环境下单个生物分子的研究。
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