来源：iNature（ID：Plant_ihuman）
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）导致COVID-19全球大流行给人类的健康与生活带来了严峻挑战。尽管COVID-19整体死亡率约为2%，但是根据中国疾病预防控制中心和意大利疫情重灾区伦巴第地区的流行病学分析显示，重症患者的死亡率高达49%1,2。同时重症COVID-19患者的尸检结果发现：重症患者肺部可见大量补体成分（C3,C4,C5,MASP-2）沉积3,4，引起肺泡膜损伤、毛细血管通透性增加和微血栓形成；并可造成肺泡上皮损伤、表面活性物质减少或消失、加重肺水肿和肺不张，最终导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。多个临床实验数据表明：抑制补体的过度激活将有助于改善重症患者的临床预后5-8。有文献指出，SARS-CoV-2核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白能够通过MASP-2激活补体系统加剧COVID-19患者的肺部损伤9。尽管目前针对该疾病重症化进展的研究较多，但靶向病毒N蛋白的大分子特异性药物研发及N蛋白介导补体异常激活的快速分析系统等方面的研究较少。
2021年5月11日，中山大学附属第五医院陈守登教授课题组，单鸿教授课题组，肖非教授课题组及暨南大学廖化新教授组成的合作团队在Nature Communications在线发表题为“A SARS-CoV-2 antibody curbs viralnucleocapsid protein-induced complement hyperactivation”的研究论文，该研究利用基于临床康复者血液样本的全人源抗体筛选方法，从中山大学附属第五医院治愈出院的COVID-19恢复期患者血液中分离出人源性SARS-CoV-2 N蛋白抗体，并通过抗原抗体复合物晶体结构解析，分析抗原表位及构象变化特点。此外，团队自主开发了离体、无病毒的补体过度激活检测系统，筛选出了能够有效抑制N蛋白引起的补体过度激活的全人源化的特异性抗体。
图1：研究工作论文首页
研究人员首先对COVID-19不同时间段（7-25天）的恢复期病人血清进行筛选，发现针对N蛋白的抗体滴度普遍高于S蛋白抗体滴度，恢复期早期（9天）的患者N蛋白抗体的滴度更高。后续研究中，研究人员从中选择了抗体滴度最高的患者（恢复期9天）血液进行PBMC的分离，进一步通过流式细胞术分离出针对N和S蛋白特异性的记忆B细胞和浆细胞。研究人员通过测序鉴定了S蛋白的5种浆细胞抗体和3种记忆B细胞抗体；N蛋白的20种浆细胞的抗体和12种记忆B细胞的抗体。从抗体的突变长度和突变氨基酸的数目来看，研究人员发现针对N蛋白抗体的成熟度要高于S蛋白【图2】。
图2：抗体的筛选及其特点
此外，研究人员通过初步的抗原表位鉴定（NTD、CTD、N-FL），和抗原抗体亲和力的测定，筛选出了结合N蛋白全长和与抗原亲和力最强的抗体nCoV396（KD=1.02 nM）【图3】。
图3:N蛋白抗体抗体对抗原的反应性和亲和力
紧接着，研究人员利用X线衍射的方法解析了N-NTD(49-173aa)和nCoV396Fab复合物高分辨率的晶体结构（PDB:7CR5）。结果显示，抗体利用其轻链CDR1、CDR3和重链CDR1、CDR2、CDR3，通过亲水和疏水相互作用识别N-NTD的C端（159-163aa）区域。NTD与抗体结合的Q163，L167和K169位点在冠状病毒中相对保守，提示该抗体可以结合其他高致病性冠状病毒的N蛋白，具有潜在广谱的应用前景。SPR分析也证实nCoV396Fab同样可以和SARS（KD=7.26nM）和MERSN蛋白结合（KD=12.6nM）。通过进一步与NTD单体（PDB:6M3M）的结构比对，研究人员发现，N蛋白结合抗体之后，NTD的C端有大约80º远离手掌区的摆动，以暴露出抗原表位，这可能导致N蛋白的NTD和CTD相对位置的变化。同时，NTD的手指区域从RNA结合区域向外移动了7.4 Å,导致了N蛋白结合RNA口袋的扩大，提示nCoV396可能影响了N蛋白结合RNA的能力【图4】。
图4: mAb nCoV396和SARS-CoV-2 N-NTD复合物结构
为了进一步验证N蛋白抗体nCoV39的功能，研究人员自主开发了一种离体检测补体过度激活状态的方法。通过利用自身免疫性疾病且C3或者C4升高的病人血清，加入MASP-2特异性荧光淬灭底物(2Abz-SLGRKIQI-Lys(Dnp)-NH2)，用酶标仪检测初始反应速率(V0)，计算最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）以反映补体激活状况。当体系中加入了SARS-CoV-2 N-FL后，随着N-FL浓度的增加，Vmax也随之增加，说明补体系统被SARS-CoV-2 N蛋白激活。令人满意的是，当体系中加入过量的nCoV396Fab，补体的激活会被抑制，其抑制补体效果与抗体的浓度呈正相关【图5】。该实验结果在多例不同补体激活的患者血液中得以重复。
图5: mAb nCoV396抑制SARS-CoV-2 N蛋白诱导的补体过度激活
总的来说，该研究分离出了首个全人源的SARS-CoV-2 N蛋白的抗体，确定了该抗体识别N蛋白的抗原表位，通过离体的补体激活实验，确定了N蛋白在补体过度激活中的作用，同时鉴定了nCoV396能够抑制N蛋白诱导的补体过度激活的功能。为补体过度激活的重症COVID-19患者提供了新的候选治疗方案的理论基础。
中山大学附属第五医院博士后康斯斯，博士研究生杨梅、何素华，暨南大学王月明为文章的共同第一作者。中山大学附属第五医院陈守登教授，单鸿教授，肖非教授及暨南大学生命科学技术学院廖化新教授为论文的共同通讯作者。该项工作得到了珠海市新型冠状病毒疫情防控应急研究（社会发展类）专项基金的支持。同时感谢上海同步辐射光源工作人员BL18U/19U/17U对X线衍射数据筛选和收集工作的帮助的支持。
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参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-23036-9
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