2021-05-06，Nature Chemical Biology (IF=12.587)上发表，M13噬菌体表面展示多价聚糖（液态糖矩阵），在细胞水平及动物水平确认了的聚糖与蛋白的多价相互作用，弥补了传统糖芯片的不足。
这篇文章发表在Nature Chemical Biology (IF=12.587)上，通讯作者是阿尔伯塔大学（加拿大）化学系的Ratmir Derda教授。研究领域是化学与生物学的交叉应用，例如，利用遗传编码的库筛选non-druggable蛋白的抑制剂，尤其是筛选能够识别复杂多糖的蛋白质。个人简介的网址为：https://www.x-mol.com/university/faculty/6498
背景介绍
糖矩阵（glycan array）（又叫糖芯片）是将多糖打印在玻片表面，是一种高通量的鉴定聚糖与糖结合蛋白相互作用的方法，常用于抑制剂、疫苗及生物治疗药物的开发。
聚糖的密度及多价展示影响其结合的亲和力（avidity）及特异性，传统糖矩阵的固相展示方法，难以模拟多价聚糖与糖结合蛋白（GBP）的动态竞争状态，也不能用于细胞表面GBP及动物体内的研究。
作者选择M13噬菌体展示聚糖，一方面因为M13没有天然的糖基化，另一方面，M13噬菌体表面有一个高丰度的pVIII蛋白（2700拷贝），利用生物正交的手段，将聚糖展示在M13噬菌体表面。通过在pVIII的5‘端插入DNA barcode库，可以产生各种不同的噬菌体，展示着各种不同密度的聚糖，可实现在细胞表面及动物体内，鉴定聚糖与蛋白的相互作用，弥补了糖矩阵的不足。作者称该新方法为液态糖矩阵（liquid glycan array，LiGA）。
研究内容简介
01液态糖矩阵（LiGA）的建立及表征
首先，为了找到噬菌体展示聚糖的最佳的pVIII蛋白结构及密度，作者在pVIII蛋白的N端插入了1010个理论可能的简并核酸序列，这段序列能够调节pVIII蛋白结构及密度，称为DNA条形码库（DNA barcode library）（见图1）。
图1：DNA条形码库的构建方法
（silent barcode region，SB region）
然后，通过连续多次增殖筛选出合适的噬菌体颗粒，并深度测序 DNA条形码，获得适合用于展示聚糖的M13噬菌体。
最后，作者根据CFG数据库化学合成了63个叠氮修饰的聚糖及另外12个叠氮修饰的聚糖。通过加入DBCO–NHS与pVIII的N端氨基反应，连接上DBCO，接着，加入带叠氮修饰的糖，通过化学点击反应，在噬菌体表面展示聚糖（见图2）。进一步通过MALDI质谱，测试展示在表面的聚糖密度。添加0.5mM、1mM、1.5mM DBCO–NHS，可实现400，700，1300拷贝的聚糖展示。
图2：液态糖矩阵（LiGA）的表征
02液态糖矩阵（LiGA）功能的确认（validation）
首先，作者在体外（in vitro）进行确认。作者构建了带GFP（绿色）标记的噬菌体用于修饰α甘露糖（α-Man），带mCherry（红色）标记的噬菌体用于修饰乳糖（Lac），及带LacZ报告基因（α-Gal，蓝色）的噬菌体（见图3a）。作者将上述3种带report的噬菌体及无report的野生型噬菌体投入到固定的ConA凝集素中（特异结合甘露糖，不结合乳糖），洗去不结合的部分，洗脱能够被ConA凝集素特异结合的噬菌体（见图3b）。发现，ConA凝集素确实能够富集展示α-Man的GFP（绿）噬菌体，而不富集展示Lac的mCherry（红）噬菌体（见图3c）。
然后，作者又在细胞水平上进行确认，鼠mCD22蛋白能够特异结合鼠唾液酸（Neu5Gc α2-6LacNAc），不结合人唾液酸（Neu5Ac α2-6LacNAc），而人hCD22能够结合这2种唾液酸。作者用CHO细胞分别表达这两种蛋白，然后将带荧光标记的液态糖矩阵（LiGA）（噬菌体糖矩阵）与细胞混合，检测荧光信号判断特异性，发现细胞表面的mCD22确实能特异捕获展示Neu5Gc的噬菌体，而细胞表面的hCD22能够捕获这2种荧光标记的噬菌体（见图3d）。
图3：液态糖矩阵（LiGA）功能的确认
最后，作者扩大到65个不同的聚糖，展示在液态糖矩阵（LiGA）上，用9种不同的凝集素去确认其特异性，并与传统的糖矩阵（糖芯片）的特异性进行的全面的比较（图谱过于复杂，详见原文）。
03液态糖矩阵（LiGA）对亲和力及亲合力的反应（affinity- and avidity-based responses）
首先，作者在纯化的凝集素蛋白上进行测试，如ConA（特异结合α-Man），G3C（特异结合Lac），Galf4单抗（特异结合Gal）。然后，作者在噬菌体上展示不同拷贝数的上述3种聚糖，用上述3种纯化的蛋白去结合。发现均能展示对应的特异性（affinity），且展示中等拷贝的聚糖比高拷贝的聚糖的亲合力（avidity）更高。见图4
图4：液态糖矩阵（LiGA）的affinity & avidity（蛋白水平）
然后，作者又进一步在细胞水平上，检测液态糖矩阵（LiGA）对亲和力及亲合力的反应。作者选择CHO细胞表达hCD22蛋白，及表达DC-SIGN的成纤维细胞，在细胞水平上也展示了同样的特异性（affinity），及多价展示的不同亲合力（avidity）（见图5）
图5：液态糖矩阵（LiGA）的affinity & avidity（细胞水平）
04动物体内 测试液态糖矩阵（LiGA）
首先，作者选择了不表达mCD22 的鼠B细胞，一种表达hCD22，一种不表达hCD22。将这两种B细胞1：1混合后，注射到小鼠体内，培养8周（图6a）。
然后将图2中的4种噬菌体（包含带绿色荧光及红色荧光的噬菌体）注射到小鼠体内，1h后安乐死，取出心、肝、脾、肺、肾进一步检测（图6b）。
最后，作者发现，在动物体内，液态糖矩阵（LiGA）也能与细胞表面的蛋白相互作用。例如，只有表达hCD22的鼠B细胞能够特异性富集人和鼠的唾液酸（Neu5Ac ，Neu5Gc），而鼠的内脏组织如心、肝、脾、肺、肾是阴性结果。
图6：液态糖矩阵（LiGA）in vivo测试（动物水平）
总结
多价的受体-配体相互作用，对信号转导、细胞识别的至关重要。作者构建了液态糖矩阵LiGA（M13噬菌体展示聚糖），每个噬菌体具有唯一的DNA barcode和精确的聚糖密度。该LiGA是通过化学点击反应将聚糖标记到噬菌体表面，可以实现不同的展示密度，模拟天然多价相互作用。在三个维度（in vitro 蛋白水平、细胞水平、in vivo动物体内）确认了该液态糖矩阵的应用。
原文刊载于【糖化学生物学】公众号
原文作者：dreamzj
原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/kI4xHhvNjPO8ZZRO24fwWw
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