响尾蛇毒和蝰蛇毒含有类凝血酶，特别是蝮亚科蛇毒更以富含类凝血酶著称。类凝血酶具有精氨酸酯酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原而使其凝固，其作用结果和人或牛的凝血酶相似，因而称之为类凝血酶。对类凝血酶的分离工作做得很多，许多蛇毒中的类凝血酶得到了纯化和部分纯化，这里介绍管丰利等(1982)从浙江产蝮蛇毒中分离、纯化类凝血酶的过程。鉴于蛇毒昂贵，有些步骤是为了综合利用而设的，读者可根据自己的情况制订纯化步骤。
1.SephadexG-25柱层析为了综合利用蛇毒中各种活性组分，
先用SephadexG-25分离活性小肽——舒缓激肽增强因子。取21g粗毒，共分为7批，每批3g,溶于10mlpH7.2,5.Ommol/L磷酸缓冲液（内含0.1mol/LEDTA)中，离心取上清液上柱（4.0cmX65cm)，用内含10—4mol/LEDTA的同一磷酸缓冲液洗脱，层析图谱如图3-13-35所示。经SephadexG-25分离后，大致分为二部分，即先洗脱的大分子蛋白质及后洗脱的小分子多肽。后者用于提取激肽增强因子，将前者的收集液合并供下一步纯化。
DE-11纤维素柱层析将上述合并液直接上事先已用pH7.2,5.0mmol/L鱗酸缓冲液平衡过的DE-11层析柱(4.0crnX95Cm)，然后用不同氯化钠浓度的同一磷酸缓冲液分级洗脱。第一个蛋白峰(No.15〜50)收集后用于磷脂酶A2的制备。具有精氨酸酯酶活力的峰，经生物活力鉴定， 第一个丶 第二个酯酶峰为激肽释放酶,但混杂有类凝血酶活力。第三个酯酶峰为类凝血酶（No.110〜124),突触前神经毒素位于其后（No.127〜163)，如图3-13-36所示。分别合并洗脱液，对蒸馏水透析后冷冻干燥备用。
DE-52层析取上述凝血酶组分冻干物100mg溶于10ml的pH8.0,5.Ommol/L磷酸缓冲液中，并用同一缓冲液平衡DE-52纤维素柱(1.5cmX14cm)。上样后用不同浓度的NaCl直线梯度洗脱。层析图谱如图3-13-37所示。精氨酸酯酶活力测定显示有一个主峰和二个小峰。主峰即为类凝血酶组分。其后的杂蛋白峰呈黄色，很可能是含核黄素辅基的L-氨基酸氧化酶。合并酯酶活力的主峰部分用饱和硫酸铵反透析沉淀，收集沉淀并用pH8.0,5.Ommol/L的磷酸缓冲液透析平衡，再在DE-52纤维素柱上重层析一次，又可除去部分杂蛋白，如图3-13-38所不。
SephadexG-75凝胶过滤将上述纯化的类凝血酶20mg溶于lml0.2mol/LNa-C1、0.02mol/LNaHC03中，样品上于SephadexG-75柱（1.3cmX150cm)，并以同一溶液洗脱，可得一对称的蛋白峰，如图3-13-39所示。它与精氨酸酯酶的活力峰相吻合。生物活力测定表明，它能使纤维蛋白原凝固，此即提纯后的蝮蛇毒类凝血酶。
提纯后的类凝血酶在7.5%或10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳上都呈一条带。用过碘酸-Schiff’s试剂作糖蛋白染色也同样可得到一条粉红色区带，位置与蛋白区带一致，说明蝮蛇毒类凝血酶为一糖蛋白。
十一、X因子激活剂的分离纯化
蛇毒中含有X因子激活剂，但分布不太广泛，这里介绍HeleneHofmann等(1987)从矛头蝮蛇毒中分离X因子激活剂的过程。
DEAE-Cellulose层析矛头峻（5沉<^mr)蛇毒溶于pH7.5，10mMTris-HC1缓冲液中（含5mmol/LBenzamidine)并对该溶液透析。经过透析后的样品上DEAE-Cellulose柱，用Omol/L〜0.2mol/LNaCl线性梯度洗脱。
50mmol/LTris-HCl缓冲液(含100mmol/LNaCl和5mmol/L苯甲脒)平衡，洗脱时也用该缓冲液，在41：下操作，流速为8ml/h。如图3-13-40和图3-13-3.DEAE-Cellulose柱层析把图3-13-38和图3-13-39中含有X因子激活剂的组分合并分别上DEAE-Cellulose柱，可获得纯的X因子激活剂蛋白。
十二、凝血酶原活化因子的纯化
有些蛇毒中含有凝血酶活化因子，其中包括锯鱗蝰泰攀蛇蛇毒。这里介绍
Frederick等（1980)从泰攀蛇蛇毒中分离纯化凝血酶激活因子的过程。
Ultrogel-22层析取出100mg的泰攀蛇（
3mlpH5.8，0.05mol/LNaAc(含0.15mol/LNaCl)中，在22°C条件下上Ultrogel-22柱（1.5cmX100cm)，每管2.5ml分部收集，见图3-13-42。
QAE-Sephadex-Q50层析把第一步分离的第35〜第45
管收集，在22°C条件下上QAE-Sephadex-Q50柱（0.9cmX
30cm)。该柱用pH5.8,0.05mol/LNaAc缓冲液(含0.15mol/LNaCl)平衡，用0.15mol/L〜0.6mol/L直线梯度洗脱，总体积100ml，每管2ml分部收集，如图3-13-43所示。
十三、血小板聚集诱导因子的分离纯化
有些蛇毒组分可以诱导血小板的聚集和释放，而有些能够抑制这种反应。血小板聚集激活因子可以分为两类：①具有酰胺水解活性的丝氨酸蛋白酶，如从矛头蝮
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(Soi/iro/^aimr)蛇毒中分离出的血小板素和从响尾蛇(Crota/奶Aorr/<it«Linnaeus)蛇毒中分离的Crotalocytin。②第二类是非酶类物质。除此之外，还有其他组分如PLA2等也可以引起血小板聚集。这里介绍Ouyang等(1986)从r/i0<ios<0OTa蛇毒中分离血小板聚集诱导因子的过程，这种诱导因子可能属于非酶类物质。
1.SephadexG-75柱层析用pH7.2,0.Olmol/L碳酸铵缓冲液平衡SephadexG-75柱(柱体积600ml)，用同样溶液溶解0.6g粗毒，离心除去沉淀后上柱。用平衡液在4°C条件下洗脱，流速36ml/h，每6ml收集一管，如图3-13-44所示。
脱条件在代进行，流速20ml/h，每4ml—管分部收集，如图3-13-45。
3.SephadexG-75和SephacrylS-300柱层析收集第二次层析后的4峰〜6峰，冷冻干燥，然后先上经pH7.2,5.Ommol/L碳酸铵缓冲液平衡后的SephadexG-75柱(柱体积100ml)，用平衡液洗脱，每管2ml分部收集，见图3-13-46左。把主要峰进一步进行两次SephacrylS-300柱层析，所用条件和第一步相同，每管lml分部收集，见图3-13-46中和图3-13-46右„