在蛋白质的纯化中，最困难、最耗费时间，而又往往最容易失败的一件事，是使蛋白质稳定于活化状态。在纯化过程每个步骤都需要保持蛋白质稳定，对此有6个因素必须考虑:①pH;②氧化程度;③重金属的浓度;④介质的极性;⑤蛋白酶的浓度;⑥温度。现将其分别叙述如下：
(—)pH
使用适当的缓冲液来调节溶液的pH是容易的，但在溶液pH的调节方面也可能涉及一些难于捉摸之处。例如:对酶而言，常常以为产生较高反应速度的pH值也是这个酶呈最稳定状态的pH。可惜这种可能并不是事实，有相当数量的例子表明，进行酶测定的最适pH和贮存时使酶处于稳定状态所需的最适pH二者之间，可相差一个或数个pH单位,因此，分别确定酶测定和酶稳定时的最适pH是非常必要的。不仅仅缓冲剂必须有合适的PH，而且必须不对蛋白质起不利的影响。磷酸和焦磷酸缓冲液在这方面很不理想，因为对一大类以无机磷酸或有机磷酸化合物作为底物或反应产物的酶来说，它们起竞争性抑制剂的作用。必须注意所使用的缓冲剂的浓度。按一般规律而言，具有大空泡的组织如植物和霉菌，如果要求pH调节得好，就需要较大的缓冲容量。在某些情况下甚至需要逐滴加入碱如氢氧化钠，以中和粗的组织匀浆，此时必须十分小心，不要使中和过程引起要分离的蛋白质发生变化。
(二）氧化程度
通常，大多数蛋白质(H)含有相当数量的游离硫氢基，可能有4或多个硫氢基参加与底物结合，因而这几个硫氢基的反应性是很活泼的。硫氢基被氧化，形成分子内或分子间的二硫键，常常导致酶活性的丧失。有很多化合物可以防止二硫键的生成:2-巯基乙醇(P=L12g/ml)、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽及巯基乙醇等。这些化合物加到蛋白质溶液中时，浓度应在5Xl(T4mol/L〜5X10—3mol/L范围内。在溶液中，酶和巯基璐份子之间发生下列的互换反应：
酶一S—S—酶+RSH酶一SH+酶一S—S—R
(无活性）（活性）（无活性）
酶一S-S-R+RSH酶一SH+R—S—S—R
(无活性）（活性）
因为这些反应的平衡常数接近于1，所以需要大大过量的保护剂。这种情况提示，巯基试剂确实起了保护剂的作用，使上述反应远远移向右侧。二硫苏糖醇和它的异构体二硫赤藓醇能满足这些标准。
二硫苏糖醇分子内形成二硫键，生成一种空间结构上允许的六元环，因此，当二硫苏糖醇被用作保护剂时，以很少量的硫醇就能提供较大的保护力量，使蛋白质对抗氧化作用。
在研究某些植物组织时，常遇到的一种氧化剂，就是酶类化合物。酶类化合物是细胞破碎时产生的，新鲜切开的苹果变琪棕色，就是这些化合物所起的作用。通常用以对抗这些强氧化剂的保护剂是聚乙烯吡咯烷酮，然而，即使用这种保护剂，蛋白质的氧化作用仍然是一个严重问题。
(三）重金属污染
除了氧化作用之外，硫氢基可能同铅、铁、铜等重金属离子起作用。这些重金属离子的主要来源是配制缓冲液所用的试剂，分离蛋白质所用的离子交换树脂，以及配制溶液用的水等。应用全玻璃蒸馏水或通过特殊制备的混合床去离子树脂所得的水，可避免重金属污染。金属容器制备的蒸馏水是不能推荐使用的。有时即使是全玻璃重蒸馏水，仍然可能还有微量重金属存在，那么，在缓冲液中加入浓度为1XlCT4mol/L〜3Xl(T4mol/L的EDTA，就可以将全部或大部有害金属离子螯合掉（如果对酶活性没有抑制作用的话)。
(四）介质的极性和离子强度
结合在膜上或其他亚细胞组分上的蛋白质的纯化工作，促进了对溶剂极性的考虑。尽管这个问题起初是在纯化膜蛋白时遇到的，而现在很清楚，溶剂的极性普遍地适用于任何蛋白质，有些蛋白质要求较为疏水的环境，可以用蔗糖、甘油以及更为强烈的试剂像二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等。使溶液的极性降低，则可能成功地把这些蛋白质保持在溶液中。适宜的浓度常必须经过探索试验来确定，但常用的浓度往往是1%〜10%(V/V)。应用这些试剂，使许多过去曾一度被认为即使小心研究仍是很不稳定的蛋白质得以纯化。但是，亦有少数蛋白质需要高离子强度的极性介质以保持其全活性。对于这些罕见的情况，可用KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2S04以提高溶液的离子强度。在这种情况下，一般就排除了使用离子交换层析法作为纯化的手段。
(五）蛋白酶或核酸酶的污染
在纯化蛋白质和核酸时，常常发生的一个问题是，在材料中有相应的蛋白酶和核酸酶的存在。在体内，除非是在仔细调节的条件下，这些有降解作用的酶是不允许与其底物接触的，但在细胞破碎时，这些酶被释放出来。如果不注意采取措施来稳定要分离的蛋白质，则酶活性继续丢失可视为是蛋白酶对被纯化的蛋白质进行降解的标志。不论什么时候遇到这种不稳定的情况，都应当考虑到这一点。有几种特异性蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟化物(PMSF)，可以部分地降低蛋白酶的活性，但有不理想的副作用存在，必须小心使用这些抑制剂，例如，PMSf与二异丙基氟磷酸(DIFP)不仅抑制蛋白酶，而且也抑制其他多种酶。
(六）温度
通常以为蛋白质在0X：时最稳定，但现在已清楚地证明鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶是对冷敏感的，仅在25X：才稳定。一个与温度有关的问题是要找到一个较好保存某种蛋白质的温度条件，在这个温度条件下，可以将蛋白质最安全地保存起来而不变坏。某些蛋白质可能以浓溶液形在0"c时保存较好，而另一些蛋白质可能需要温度低至一2(TC或一70°C才能保存其活性。以为条件越冷，蛋白质的稳定性越大的假定是不正确的，因为某些蛋白质溶液经受冰冻和融溶处理是十分有害的。如果观察到这种现象，则在冰冻之前在制剂中加入甘油或少量的二甲基亚砜可能会有所帮助。每种蛋白质的储存条件，必须通过探索试验来确定，并且在纯化过程的每一步都需要考虑到这一点。