来源：iNature（ID：Plant_ihuman）
噬菌体和质粒等移动遗传元件已经进化出抗 CRISPR 蛋白 (Acrs) 来抑制 CRISPR-Cas 适应性免疫系统。最近，据报道，包括 AcrIIA17 和 AcrIIA18 在内的几种噬菌体和非噬菌体衍生的 Acrs 通过调节 sgRNA 来抑制 Cas9。
2021年12月10日，天津医科大学张恒和银行共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=17）在线发表题为“Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA17 and AcrIIA18”的研究论文，该研究展示了AcrIIA17 和 AcrIIA18 通过不同的机制使 Cas9 失活。AcrIIA17 通过干扰 Cas9-sgRNA 二元复合物的形成来抑制 Cas9 活性。相比之下，AcrIIA18 以 Cas9 依赖性方式诱导 sgRNA 的截断，产生无法触发 Cas9 活性的缩短的 sgRNA。
AcrIIA18 的晶体结构与诱变研究相结合，揭示了 AcrIIA18 中 N 端 β-发夹在 sgRNA 切割中的关键作用。AcrIIA18 的酶抑制机制不同于其他报道的 II 型 Acrs。该研究结果为 Acrs 对 CRISPR-Cas9 抑制的机制理解增加了新的见解，并为 CRISPR-Cas9 的条件操作工具的设计提供了有价值的信息。
CRISPR-Cas 系统由CRISPR和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白组成，是 RNA 引导的适应性免疫系统，用于细菌和古细菌抵抗诸如噬菌体和质粒等移动遗传元件 (MGE)。已识别的 CRISPR-Cas 系统大致分为多效应器系统（第 1 类）和单效应器系统（第 2 类），涵盖六种类型 (I-VI) 和各种亚型。其中，II型CRISPR-Cas9系统在基因组编辑应用中得到了广泛的应用。
在噬菌体感染期间，Cas 蛋白复合物（如 Cas1-2）在适应阶段将外源 DNA 的短片段获取到其自身的 CRISPR 阵列中。随后，作为记忆库的 CRISPR 阵列通常被转录成单个 pre-CRISPR RNA（pre-crRNA），然后进一步加工成成熟的 crRNA。在噬菌体再感染时，由 crRNA 引导的 Cas 效应器识别并切割与 crRNA 互补的侵入性核酸 。此外，一小段核酸，称为目标 DNA 的原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，通常对识别和降解至关重要。
AcrIIA17 与 BH 结构域结合（图源自Nucleic AcidsResearch）
细菌和噬菌体之间的竞争推动了它们的共同进化。一些 MGE 尤其是噬菌体已经进化出反击策略，包括抗 CRISPR 蛋白 (Acrs) 以阻止 CRISPR 防御反应 。自从在铜绿假单胞菌的噬菌体中首次发现以来，已经鉴定了数十种 Acrs。迄今为止，已在结构和生化上表征了几种 II 型 Acrs。
II 型 Acrs 的一种常见阻断机制是结合和限制 Cas9 核酸内切酶活性所需的构象变化。例如，AcrIIA14、AcrIIC1 和 AcrIIC3 与 HNH 核酸酶结构域结合以将 Cas9 捕获在无催化能力的构象中。AcrIIA6 主要与 WED 和 PI 结构域相互作用以变构改变 Cas9 的构象动力学。另一种常见的抑制策略是通过模仿 PAM 来阻止目标 DNA 结合，这被 II 型 Acrs 共享，包括 AcrIIA2 和 AcrIIA4。最近的研究还揭示了一些不同的抑制策略，例如在诱饵位点减轻 DNA 扭转和捕获 Cas9 。
AcrIIA18 触发 sgRNA 截断，该产物无法诱导 Cas9 介导的 DNA 切割（图源自Nucleic Acids Research）
最近公布了几种新型 II 型 Acrs (AcrIIA16-19) 以灭活 CRISPR-Cas9 系统 。在 CRISPRi 测定中，AcrIIA16-19 对 Cas9 表现出与 AcrIIA4 相似的抑制作用，表明 AcrIIA16-19 是 Cas9 的有效抑制剂。免疫共沉淀实验揭示了 Cas9 和 AcrIIA16-19 之间的直接相互作用。此外，与 AcrIIA17 或 AcrIIA18 共表达和共纯化的 Cas9 蛋白对体外靶 DNA 切割无活性。Northern印迹分析表明，在体内存在AcrIIA17的情况下，sgRNA降至未检测到的水平，表明sgRNA加载或生物发生受到抑制。相比之下，sgRNA 在体内被 AcrIIA18 截断。
在该研究中，从生化和结构上表征了 AcrIIA17 和 AcrIIA18 的抑制作用。AcrIIA17 与桥螺旋 (BH) 结构域结合以抑制 Cas9-sgRNA 核糖核蛋白 (RNP) 复合物组装。引人注目的是，AcrIIA18 将 sgRNA 切割到不足以触发 Cas9 核酸内切酶活性的长度。这种酶促机制不同于上述 II 型 Acrs 机制。这些结果不仅为 II 型 Acrs 的 Cas9 抑制机制提供了新的见解，而且还可能促进 CRISPR-Cas9 系统关闭工具的开发。
天津医科大学基础医学院张恒教授和银行博士为本文共同通讯作者，2021级博士生王枭燊和李徐梓超为本文的共同第一作者。该工作得到了上海同步辐射光源的帮助和支持。
参考消息：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab1197/6459077
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