来源：iNature（ID：Plant_ihuman）
活细胞超分辨率 (SR) 显微镜空间分辨率的一个主要决定因素是可以收集的最大光子通量。
2021年11月15日，哈尔滨工业大学李浩宇与北京大学陈良怡共同通讯在Nature Biotechnology（IF=55）上发表题为“Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy”的研究论文，该研究为了进一步提高给定光子通量的有效分辨率，利用关于生物结构稀疏性和连续性的先验知识来开发一种反卷积算法，将 SR 显微镜的分辨率提高近两倍。
该研究的稀疏结构照明显微镜 (Sparse-SIM)，在高达 564 Hz 的帧速率下实现了~60 nm 的分辨率，使其能够解析复杂的结构，包括小的囊泡融合孔、由核孔蛋白形成的环形核孔以及活细胞中线粒体内外膜的相对运动。稀疏解卷积也可用于提高基于旋转圆盘共焦的 SIM 的三维分辨率，即使在低信噪比下，这也允许在 ~90纳米分辨率下进行四色、三维活细胞 SR 成像。总体而言，稀疏解卷积将有助于提高活细胞荧光显微镜的时空分辨率。
尽管理论上分辨率不受限制，但活细胞成像中 SR 显微镜的空间分辨率仍然有限。由于活细胞中快速移动的亚细胞结构的运动伪影，如管状内质网 (ER)、脂滴、线粒体和溶酶体，空间分辨率的任何增加都必须与时间分辨率的增加相匹配。因此，当前实时 SR 显微镜的最高分辨率仅限于 ~60 nm，无论使用何种方式。为了实现该分辨率，通常需要过度的照明功率 (kW-MW mm-2) 和长时间曝光 (>2 s)，这可能会损害整体荧光结构的完整性并降低可实现的分辨率。
之前，研究人员为 SIM 开发了一种 Hessian 反卷积算法，它可以在活细胞中实现超快和长达一小时的 SR 成像。然而，它的分辨率受限于线性空间频率混合造成的 90-110 nm。具有 ~60 nm 分辨率的非线性 SIM 以降低时间分辨率为代价，并且需要对光漂白敏感的可光活化/光开关荧光蛋白。由于细胞深层内部的分辨率和对比度仍然受到荧光发射和离焦平面散射的影响，因此高对比度 SR-SIM 成像在很大程度上仅限于 0.1 到 1 μm 的成像深度。迄今为止，没有一种 SR 方法能够在活细胞中实现约 60 nm 时空分辨率的毫秒级曝光，或者能够进行多色、三维 (3D) 长期 SR 成像。
Sparse-SIM解析不同距离DNA折纸样本。（a）在相同视场下，用配对Cy5标记不同距离（60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm）的DNA折纸样品，用TIRF（左）、TIRF-SIM（中）和Sparse-SIM（右）成像。（b）在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下，黄色（60 nm）、蓝色（80 nm）(80 nm)、绿色（100 nm）和红色（120 nm）框包围的放大区域。比例尺：（a）2 μm；（b）100 nm。
或者，在 1960 年代首次提出可以在不修改硬件的情况下提高 SR 的数学带宽外推法。因此，当被成像物体的尺寸有限时，存在一个独特的解析函数，该函数与光学传递函数 (OTF) 的带宽受限频谱带内重合，从而能够通过外推观察到的光谱来重建完整的物体。例如，迭代Richardson–Lucy (RL)解卷积可以在天文成像中分离双星时超过Rayleigh标准。然而，这种天文 SR 成像后来被证明在太阳系中是不可行的。最近，压缩传感范式也使 SR 在原理验证实验中成为可能。然而，这些带宽外推方法在实际应用中失败了。因此，尽管理论上可行，但人们普遍认为，Rayleigh衍射极限代表了一个实际前沿，无法通过对从传统成像系统获得的图像应用带宽外推方法来克服。
在这里，该研究表明 RL 去卷积提高了合成、带宽受限、无噪声荧光图像的分辨率，但在包含噪声的真实显微图像中失败。该研究通过结合稀疏性和连续性作为先验知识来约束后续迭代反卷积的算法，克服了当前 SIM、旋转圆盘共焦 SIM (SD-SIM)、受激发射耗尽 (STED)、宽-场、共聚焦、双光子和膨胀显微镜 (ExM)的分辨率限制。因此，该研究的稀疏解卷积算法可以帮助当前的荧光显微镜突破其时空分辨率限制，并更好地解析活细胞中复杂的 3D 和快速动态。
总之，通过稀疏解卷积算法（Sparse deconvolution）来实现计算荧光超分辨率成像，与目前基于特定物理原理或者特殊荧光探针的超分辨率方法都不相同。与超快结构光超分辨显微镜结合形成的Sparse-SIM是目前活细胞光学成像中，分辨率最高（60纳米）、速度最快（564帧/秒）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨光学显微成像手段。它也可以与现有的多数商业荧光显微镜结合，有效提升它们的空间分辨率，看到更清楚的精细结构动态。
哈尔滨工业大学博士生赵唯淞、北京大学博士后赵士群、李柳菊为共同第一作者，哈尔滨工业大学仪器科学与工程学院李浩宇教授和北京大学未来技术学院陈良怡教授为论文共同通讯作者，共同作者还包括哈尔滨工业大学谭久彬院士、刘俭教授，北京大学毛珩博士，生科院成像平台单春燕博士和华南师范大学刘彦梅教授。参与合作的实验室包括武汉大学宋保亮教授、北京大学陈兴教授、中科院国家纳米科学中心丁宝全教授和生物物理所纪伟教授等。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-021-01092-2
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