来源：iNature（ID：Plant_ihuman）
原核生物通过在 CRISPR 阵列中整合源自外源 DNA 的间隔区来适应移动遗传元件的挑战。间隔插入由 Cas1–Cas2 整合酶复合体进行。很大一部分 CRISPR-Cas 系统使用包含 Cas4 核酸酶的 Fe-S 簇来确保间隔区是从 DNA 中获得的，两侧是原始间隔区相邻基序 (PAM)并单向插入到 CRISPR 阵列中，以便转录的 CRISPR RNA 可以以依赖于 PAM 的方式指导靶标搜索。
2021年9月29日，康奈尔大学可爱龙及代尔夫特理工大学Stan J. J. Brouns共同通讯在Nature在线发表题为“Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR–Cas”的研究论文，该研究提供了对Geobacter sulfurreducens中 I-G CRISPR 型Cas4 辅助 PAM 选择、间隔区生物发生和定向整合的高分辨率机制解释，其中 Cas4 与 Cas1 自然融合，形成 Cas4/Cas1。
在生物发生过程中，只有具有 PAM 嵌入的 3'-突出端的 DNA 双链体才能触发 Cas4/Cas1–Cas2 组装。在此过程中，PAM 突出端被特别识别和隔离，但不会被 Cas4 切割。这种“分子便秘”阻止了 PAM 侧的预间隔参与整合。由于缺乏这种隔离，非 PAM 突出端被宿主核酸酶修剪并整合到前导端 CRISPR 重复序列中。半整合随后触发 PAM 裂解和 Cas4 解离，允许间隔侧整合。
总体而言，该项研究首次报道了CRISPR-Cas系统中，Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制，此外通过一系列结构生物学和生化方法揭示了Cas4调控的Prespacer方向性整合的一整套分子机制。这项工作，为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作，尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。
原核生物具有独特的能力，通过在 CRISPR 重复序列之间整合 DNA 短片段（间隔区），获得针对移动遗传元件的免疫记忆。重复间隔区的阵列被转录以产生指导 CRISPR 效应复合物 DNA 或 RNA 靶标进行切割的向导 RNA。靶向 DNA 的 CRISPR-Cas 系统还需要在 PAM 附近获得间隔区。
PAM 帮助 CRISPR RNA (crRNA) 引导的复合物区分 CRISPR 阵列中的真正靶标和间隔区，从而防止致命的自我靶向。PAM 还通过显著减少候选点的总数来加速靶标搜索过程。为确保 CRISPR 间隔区仅源自 PAM 侧翼序列，I 类（IA、IB、IC、ID、IG）和 II 类（II-B、VA、VB 型）CRISPR-Cas 系统进一步编码专用的 CRISPR适应蛋白 Cas4，与包含 Cas1 和 Cas2的核心间隔区获取机制协同工作。
Cas4系统运行机制的模式图（图源自Nature）
早期研究主要表明，在 Haloarcula hispanica中的 I-B 型系统和 Sulfolobus islandicus中的 I-A 型系统中，cas4 的缺失会损害间隔区的获得。最近在 Pyrococcus furiosus中使用 I-A 型、在Synechocystis sp中使用 I-D 型以及在硫还原菌中使用 I-G 型（以前称为 I-U）的更多研究确立了 Cas4 在获得具有功能性 PAM 的间隔物方面的关键作用。发现 Cas4 蛋白含有 Fe-S 簇并催化各种外切和内切核酸酶活性 。
最近在 I-C 嗜盐芽孢杆菌中的工作表明，Cas4 使用其核酸酶活性在间隔前体整合到 CRISPR 阵列之前切割 PAM 序列。后续工作表明，Cas4 与 Cas1 的二聚体形成复合物，并在前间隔区结合后与 Cas2 结合。
该研究提供了对Geobacter sulfurreducens中 I-G CRISPR 型Cas4 辅助 PAM 选择、间隔区生物发生和定向整合的高分辨率机制解释，其中 Cas4 与 Cas1 自然融合，形成 Cas4/Cas1。
在生物发生过程中，只有具有 PAM 嵌入的 3'-突出端的 DNA 双链体才能触发 Cas4/Cas1–Cas2 组装。在此过程中，PAM 突出端被特别识别和隔离，但不会被 Cas4 切割。这种“分子便秘”阻止了 PAM 侧的预间隔参与整合。由于缺乏这种隔离，非 PAM 突出端被宿主核酸酶修剪并整合到前导端 CRISPR 重复序列中。半整合随后触发 PAM 裂解和 Cas4 解离，允许间隔侧整合。
总体而言，该项研究首次报道了CRISPR-Cas系统中，Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制，此外通过一系列结构生物学和生化方法揭示了Cas4调控的Prespacer方向性整合的一整套分子机制。这项工作，为我们更深刻地了解CRISPR-Cas的运作，尤其是系统如何搜集外源入侵者情报这一步做出了非常好的解释。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03951-z
本文版权归原作者所有，文章内容不代表平台观点或立场。如有关于文章内容、版权或其他问题请与我方联系，我方将在核实情况后对相关内容做删除或保留处理！联系邮箱: yzhao@koushare.com