来源：iNature（ID：Plant_ihuman）
目前，野生型 (WT) 仓鼠、雪貂、猫和非人类灵长类动物被用作 COVID-19 动物模型。然而，这些动物没有出现严重的临床症状。同样，大多数人类 ACE2 (hACE2) 转基因小鼠模型仅发生轻度 COVID-19 疾病，只有少数近期转基因小鼠模型发生严重和致命的呼吸道疾病，需要更好的大型动物模型模拟所有的 COVID-19 症状。尽管一般认为猪是人类疾病的更好模型，但由于其与人体解剖学、生理学和免疫学的相似性，先前的研究表明，WT 猪对 SARS-CoV-2不敏感。
2021年8月17日，中国农业大学吴森教授、中国科学院动物所余大为博士和中国科学院微生物所毕玉海研究员共同通讯在Cell Discovery在线发表题为“Establishment of a humanized swine model for COVID-19”的研究论文，该研究报道了通过基因编辑和体细胞克隆技术，创建了新冠病毒受体（hACE2）人源化的猪模型，该模型可用于研究COVID-19重症患者的基本疾病机制、治疗候选药物的疗效和安全性提供支持。该研究预测hACE2模型猪的构建将在新冠病毒疫情防治领域发挥独特的优势，在新药研发和疫苗制备等方面有所突破。
由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)大流行导致了一场严重的全球公共卫生危机。截止2021年8月份，全球共有213个国家和地区存在确诊，累计确诊患者超过2亿例，死亡人数超400万例。而对COVID-19临床救治和药物、疫苗研发、检测技术创新、病毒溯源、生物安全等方面研究都绕不开动物模型，特别是在疫苗的研制过程中需要在大量的动物模型中进行疫苗的有效性、免疫原性、安全性等一系列复杂的测试工作。
图1使用CRISPR/Cas9定点整合技术获得hACE2人源化猪模型
（a）通过CRISPR/Cas9介导的HDR在猪胎儿成纤维细胞中实现hACE2基因定点整合的技术方案；（b）克隆仔猪的外观表型；（c）hACE2克隆猪的转录分析显示hACE2在克隆仔猪不同组织中的mRNA表达水平。在3头knock in巴马猪的各个组织中（脑除外）均能检测到hACE2表达的显著上调，其中在气管、脾脏和胰腺中上调最明显。数据以平均值±SD表示，并由三个独立实验绘制。**P< 0.01, ***P< 0.001, n = 3, unpaired one-tailed Student's t-test;（d）Western blot显示hACE2蛋白在WT和敲入(1, 2, 3)克隆仔猪中的表达，kDa, kilodalton；（e）使用免疫荧光分析hACE2蛋白(绿色)在WT和敲入仔猪的肺、肾、小肠和脑中的定位，细胞核经DAPI染色(蓝色)，随机选择有代表性的图像；比例尺，50 μm；（f）hACE2敲入克隆猪原代上皮细胞在SARS-CoV-2感染后表现出明显的细胞病变效应；比例尺，50 μm；（g）Western blot分析WT和敲入克隆猪原代上皮细胞培养中病毒N蛋白的表达。K，肾上皮细胞。L，肺上皮细胞。
新冠肺炎患者表现出从无症状到严重肺炎甚至死亡的广泛疾病症状。由于SARS-CoV-2感染的临床体征、恢复和传播在种间和种内各不相同，仅仅依靠某个动物模型并不能很好的模拟人类临床所表现的症状，而且可能具有误导性。2020年3月，NatureNews近日发表了题为“Labs rush to studycoronavirus in transgenic animals — some are in short supply”的报道，特别指出hACE2转基因小鼠与恒河猴动物模型相似，只患上轻微的疾病，体重减轻，出现肺炎的迹象，但并不严重。除此之外，小鼠模型还存在生理特征与人类相差甚远，以及灵长类模型存在的繁殖周期长、饲喂养殖成本高和伦理限制等先天缺陷，限制了这些动物模型在新冠疫情防治中的进一步应用。美国爱荷华大学冠状病毒学家Stanley Perlman对此评论：只出现轻微感染的动物可能对测试药物和疫苗作用有限，且它们可能不能帮助科学家了解更严重的病例，科学家仍需要开发新的动物模型来模拟重症COVID-19病例，帮助拯救危重症患者，助力疫苗和药物研发。
由于大多数COVID-19重症病例的特点是具有潜在的慢性疾病，因此需要包含这些已存在疾病的动物模型来重现COVID-19重症病例。除了导致因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)形式的急性肺损伤(ALI)之外，部分COVID-19患者还可能出现器官损害，包括急性肾、心、肝功能障碍1-3。高血压、心血管疾病和糖尿病等共病2。因此，相关有效的重症COVID-19模型应优先考虑重症COVID-19最常见的共病，如代谢综合征、2型糖尿病和高血压以及一些老年性疾病。为了全面了解和治疗COVID-19疾病，需要开发一种适合的对SARS-CoV-2病毒易感并伴有人类所见的共病情况的动物模型。猪由于在器官大小、生理结构、代谢等各方面接近于人类，因此被广泛的应用于人类疾病模型制备、人类异种器官移植等领域。猪还会因饮食引起的肥胖而发展出强大的代谢综合征和心肺疾病，在患有代谢综合征的猪鼻内接种呼吸道冠状病毒，会出现急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭、弥漫性肺泡损伤以及血液炎症反应和肺纤维化等症状，类似于患有严重COVID-19的代谢综合征患者。因此，在这些优势的基础之上，人源化hACE2转基因猪动物模型可加速COVID-19高危人群基础疾病机制、生物标志物和治疗方法的研究。
在本研究中，中国农业大学吴森教授领衔的联合攻关团队通过位点特异性敲入人血管紧张素转换酶2 (hACE2)取代猪的ACE2，建立了新冠肺炎猪模型。hACE2蛋白在猪内源性ACE2启动子的调控下，在几乎在所有组织中都有高表达（脑组织除外）。此外，hACE2人源化猪模型的肺和肾中分离出来的原代上皮细胞对SARS-CoV-2感染高度敏感，并表现出明显的细胞病变效应和对病毒N蛋白的高免疫荧光信号。考虑到当前变种新冠病毒全球流行向更大范围展开，极有可能长期存在，猪等大动物模型的开发有可能显著促进和加速SARS-CoV-2/COVID-19研究。该模型可用于研究COVID-19重症患者的基本疾病机制、治疗候选药物的疗效和安全性提供支持。该研究预测hACE2模型猪的构建将在新冠病毒疫情防治领域发挥独特的优势，在新药研发和疫苗制备等方面有所突破。
中国农业大学吴森教授、中国科学院动物所余大为博士和中国科学院微生物所毕玉海研究员为本文共同通讯作者。中国农业大学杜旭光副教授、郭紫航博士，以及中国科学院微生物所范文辉博士、中国科学院动物所海棠博士为本文并列第一作者。本研究得到了三亚崖州湾科技城管理局科研重大项目、国家自然科学基金、北京市“双一流”经费科研项目等经费支持。
参考文献：
1.Chen, N.et al.Epidemiological and clinicalcharacteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan,China: a descriptive study.Lancet395, 507-513,doi:10.1016/s0140-6736(20)30211-7 (2020).
2.Wang,D.et al.Clinical Characteristics of138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus-Infected Pneumonia inWuhan, China.Jama323, 1061-1069,doi:10.1001/jama.2020.1585 (2020).
3.Yang,X.et al.Clinical course andoutcomes of critically ill patients with SARS-CoV-2 pneumonia in Wuhan, China:a single-centered, retrospective, observational study.Lancet Respir Med8,475-481, doi:10.1016/s2213-2600(20)30079-5 (2020).
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41421-021-00313-x
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