摘要
近日，《德国应用化学》(Angewandte Chemie International Edition)在线发表了山东大学微生物国家重点实验室的吴长生教授和李越中教授课题组完成的研究工作“Myxadazoles, Myxobacterium-Derived Isoxazole-Benzimidazole Hybrids with Cardiovascular Activities”。该工作报道了一类具有心血管活性的天然的异噁唑-苯并咪唑先导化合物黏菌唑（myxadazole），揭示了其脂肪酸链是由一条非典型的PKS/NRPS基因簇所编码，N-核糖醇基-5,6-二甲基苯并咪唑则来自维生素B12代谢途径，推测该化学骨架由“碳-氮”交叉耦合形式构建而成。
内容
微生物天然产物是人类新药发现的重要源泉，而人类对新颖活性先导化合物的需求一直是如饥似渴。尽管该领域的研究一度因为高度重复发现而陷入困境，但随着微生物基因组测序的普遍，人们发现微生物中存在海量的沉默基因簇未被开发，新药挖掘的潜力巨大。其中，黏细菌是公认的一类次生代谢产物丰富的微生物种群。然而，由于黏细菌生长慢、难培养、资源难以获得等特点，我国对黏细菌天然产物的研究十分滞后。
吴长生、李越中教授课题组在黏细菌天然产物的挖掘过程中，从一株分离自西藏洞措湖沉积物的黏细菌Myxococcussp.SDU36中发现并鉴定出了一类新颖的黏菌唑结构。通过建立该菌株粗提取物的分子网络，从中找到了少量的黏菌唑同系物。通过二级质谱离子碎片信息，作者从其断裂情况中推断出结构变异均发生在异噁唑环和末端羧基之间（图1），这为之后的生物合成推导提供了重要线索。
图1.黏菌唑的质谱分子网络分析
为了探究黏菌唑的生物合成机制，基于黏菌唑中含异噁唑脂肪酸片段的特点，作者以[1-13C]-乙酸钠饲喂SDU36，证实黏菌唑结构里的脂肪酸片段确实来自于PKS途径。又由于该脂肪酸链异噁唑杂环的生成涉及氮原子的引入，作者利用AntiSmash对SDU36全基因组进行分析，锁定了一条非典型的PKS/NRPS生物合成基因簇mdz。随后对两个核心的PKS基因mdzE和mdzI进行插入失活，证明mdz确系参与了黏菌唑的生物合成。且mdzI失活后，依然能检测到黏菌唑C和D（少了一次C2单元的延伸），从而确定了mdzE先于mdzI工作，且mdzA这一游离的TE结构域可独立工作（图2）。考虑黏菌唑中的5,6-二甲基苯并咪唑片段仅报道存在于维生素B12中，且发酵培养基的配方中也存在维生素B12，因此作者推测维生素B12的代谢途径也参与进了黏菌唑的生物合成。作者采用前体导向生物合成（Precusor-directed Biosynthesis）的方法，以维生素B12分别饲喂培养于CTT和VY/2两种培养基中的SDU36，定量分析培养结束时粗提取物中的黏菌唑含量，发现饲喂了维生素B12后，黏菌唑的含量得到了显著提升，可间接证明N-核糖醇基-5,6-二甲基苯并咪唑则来自维生素B12代谢途径。作者推测这两条完全不同的生物合成途径是通过一个“碳-氮”交叉耦合而构建出黏菌唑的新奇化学骨架。尽管人们已经熟知微生物中普遍存在不同生物合成途径的杂合，如聚酮-非核糖体多肽（PKS/NRPS）、聚酮-萜（PKS/terpene）等，黏菌唑的生物合成途径中所涉及的杂化方式是前所未有的。可以想象，微生物中潜藏了更多未被人知的杂化途径所造就的“未知的未知物（unknown unknowns）”。
图2.黏菌唑的生物合成推导。（A）黏菌唑脂肪酸片段生物合成由非经典PKS/NRPS杂合生物合成基因簇mdz负责。MdzI蛋白中最后一个推定的TE结构域可能是无活性的。（B）推测的维生素B12生成N-核糖基-5,6-二甲基苯并咪唑的过程。推测孤儿生物合成基因簇rib中含有的ribG是催化核糖基开环转化为核糖醇基的关键还原酶。（C）代表性产物黏菌唑A和C。
作者对分离出的黏菌唑A1/A2和B进行了抗菌、抗真菌、细胞毒、抗氧化和抗炎等活性测试，未观察到显著活性。心血管活性实验结果证实：黏菌唑A1/A2和B（1–3）能明显促进损斑马鱼的血管生成，在10 µM和25 µM剂量下可对PTK787诱导破坏掉的血管进行修复，其修复能力与丹红注射液（阳性对照，9µL/mL）的修复能力相当；同时还证实：黏菌唑A1/A2和B在10 µM和25 µM浓度下也对血栓具有一定的缓解作用，治疗效果分别为31.7%和59.0%（阳性对照组160 µM阿司匹林的治疗效果为71.1%）（图3）。黏菌唑对斑马鱼心血管生成的促进作用和抗血栓作用十分可观，有望促进新一代心血管系统药物的开发和应用。
图3.黏菌唑对斑马鱼的促血管生成作用和抗血栓作用
同时，作者在文章中最后指出，尽管当今基因组挖掘途径已成为微生物天然产物领域的一种重要手段，然而该方法目前仍然难以驾驭微生物中“多条基因簇相互交流”的情况，仍需开发多样化的有效工具，以最大限度挖掘微生物天然产物“暗物质”，造福人类！
导师
2011年受中国留学基金委建设高水平博士生项目资助，于荷兰莱顿大学攻读博士学位，从放线菌中寻找新型抗生素；2017年获得荷兰国家自然科学基金委优秀博士后项目资助赴美国洛克菲勒大学进行博士后进修，从事宏基因组学方法挖掘新型钙依赖抗生素。2019年6月全职回国，加盟山东大学微生物技术国家重点实验室，任教授、博导，致力于黏细菌天然产物的发现及其合成生物学改造。在J. Am. Chem. Soc.,Angew. Chem. Int. Ed.,Org. Lett.,J. Nat. Prod.等天然产物化学领域的权威期刊发表学术论文，授权国际专利1项。目前，吴长生教授与李越中教授团队进行深度合作，综合整合核磁代谢组学、质谱代谢组学、基因组学三大工具的互补性优势，对黏细菌资源库中的菌株进行高通量筛选，实现的黏细菌来源的天然产物“暗物质”的高效挖掘；之后，对所发现的结构新颖、活性突出的先导化合物，通过分子生物学、酶化学等手段进行生物合成研究，指导合成生物学的结构改造，促进成药。
招聘
吴长生教授课题组长期招聘天然产物化学、有机合成、分子生物学、生物化学、生物信息学等相关领域的博士、博士后，急需有机合成背景的人才，有兴趣的可以联系wuchangsheng@sdu.edu.cn。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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