摘要
发展高效可持续的合成方法是当前化学工业领域的重要趋势。近年来，致力于实现绿色非天然反应的人工酶得到了越来越多的关注。与天然酶相比，通过向蛋白骨架中引入非天然催化基团而构建的人工酶可催化更加广泛的反应类型。天然酶的高效性通常是依靠多位点的协同作用实现，而目前人工酶的研究仍多集中于单一催化位点的引入，由此所致的低反应活性与底物局限性，极大地限制了其在实现高效催化非天然反应中的发展和应用。2020年荷兰格罗宁根大学的Gerard Roelfes教授和周志博士在国际顶尖期刊Nature Catalysis上报道了通过理性设计向蛋白骨架中引入两个非天然催化位点实现了首例人工金属酶催化的不对称协同催化反应（Nat. Catal.2020, 3, 289,详见往期推荐1）。此研究为实现酶催化非天然反应提供了新的思路和非常有效的方法。
不对称质子化是一种构建α手性中心的有效方法。但是由于质子的小体积性和高活性，不对称质子化过程通常很难控制，特别是在水相中更具挑战。近日，江南大学周志教授和格罗宁根大学Gerard Roelfes教授利用课题组之前构建的人工金属酶协同催化体系实现了一例串联的迈克尔加成/不对称质子化反应，并得到了非常优异的立体选择性。此人工金属酶协同催化体系的构建是基于两种人工酶设计策略：通过基因编码引入具有催化活性的非天然氨基酸（Nat. Chem.2018, 10, 946）和通过超分子组装引入金属络合物（J. Am. Chem. Soc.2015, 137, 9796）。此研究展示了人工金属酶协同催化体系在解决挑战性化学反应中具有较大潜力。
内容
该人工酶的设计是基于一种乳酸乳球菌多药耐药性调节剂（LmrR）。此蛋白是一个小型的同形二聚体，在二聚体界面上有一个异常大的疏水性空腔，空腔中心有两个相互平行色氨酸残基可以通过π堆积作用去结合外来平面分子（图1a）。之前该课题已经组运用LmrR蛋白的此种特性去结合非天然金属辅助因子例如菲咯啉铜Cu (1,10-phenanthroline)(NO3)2来构建人工金属酶并实现了吲哚对烯酮的不对称加成反应。其中，菲咯啉铜辅助因子作为路易斯酸来活化烯酮（图1b）。 另一个策略是运用扩展遗传密码的方法即琥珀终止密码子抑制技术来引入具有催化活性基团的非天然氨基酸。最近该课题组应用这种方法构建了一个含有非天然的对氨基苯丙氨酸（pAF）残基的人工酶。在此人工酶中，对氨基苯丙氨酸的苯胺侧链被用作亲核性催化基团来促进醛转化成为腙。该反应机理涉及亚胺离子中间体的瞬时形成。这也是许多有机催化反应中常见的活化策略（图1c）。
在这项研究中使用的LmrR蛋白变体为LmrR_V15pAF，其疏水空腔内的15位含有一个非天然的pAF残基。pAF残基可以通过专用的正交翻译系统直接引入。然后路易斯酸位点通过向LmrR_V15pAF蛋白缓冲液中加入Cu(ll)-phen经超分子自组装结合。作者选用了一种反应活性非常低的咪唑酮（1a）作为迈克尔供体，但其可以在金属路易斯酸的作用下烯醇化。然后加成到2-甲基丙烯醛（2a）上得到串联迈克尔加成/不对称质子化产物（3a）（表1）。
当作者使用蛋白LmrR_V15pAF与Cu(ll)-phen的协同组合时，该模板反应能够得到26%的收率和89%的ee。对照实验显示仅有一个催化位点是不能实现该反应的。这也充分说明了该反应是通过协同催化的过程实现的（表1）。
表1.人工金属酶协同催化的串联迈克尔加成/不对称质子化反应。
总结
周志教授和Gerard Roelfes教授展示了通过理性设计向蛋白中引入两种非天然催化位点的方式来构建人工金属酶协同催化体系，并利用该体系成功实现了挑战性的串联迈克尔加成/不对称质子化反应。该人工酶设计策略是通过遗传编码非天然的具有催化活性的pAF残基与利用超分子结合向LmrR蛋白二聚体界面疏水腔引入催化活性Cu配合物的协同组合而产生的。此种设计具有高度灵活性，并允许引入其他类型的有机催化非天然氨基酸，并可以结合其他金属配合物。这项研究展现了人工金属酶协同催化体系在解决挑战性化学反应中的强大能力，并且非常有潜力扩展酶催化非天然反应在有机合成当中的应用。
本研究为实现酶催化非天然反应提供了有效的方法。相关研究结果已发表在国际期刊《ACS Catalysis》上。江南大学周志教授为该论文的第一兼共同通讯作者，荷兰格罗宁根大学Gerard Roelfes教授为论文的另一共同通讯作者。
原文刊载于【遇见生物合成】公众号
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