(一）凝胶柱的制备
凝胶种类的选择一种混合物的分离程度主要取决于凝胶颗粒的孔径和被分离物质分子量的分布范围，其次还受凝胶的交联度的影响。交联度决定了被排阻物质分子量的下限。移动缓慢的小分子物质在低交联度凝胶上是不易分开的，因此，大分子与小分子物质的分离常采用高交联度的凝胶。
凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细者分离效果较好，但流速很慢，因此,在用作大量制备时，多选用粗粒者。
凝晈的用量凝胶的用量与所用层析柱子的大小有关。一般来说柱的直径与高之比为1:10〜1:20。凝胶床的高度取决于分离的性质，如样品脱盐时，流床为样品体积的5倍即可，若分离的物质分子量比较接近时，则用细而长的柱子为宜(如1:100或更大），这样可以提高凝胶层析分离的灵敏度，但是过细的柱子有时管壁效应值得注意。柱子大小决定之后，3.凝胶粒的水化干胶除用于样品浓缩外，一般都需要充分的水化，方法是将干胶悬浮于5倍〜10倍量的水或洗脱液中。较好将干胶往水里加，边加边搅，以防胶粒凝聚在一块，待干胶完全水化，形成均匀的悬浮液后，放置室温中备用。如果因急需干胶快速水化，可将凝胶悬浮于5mol/L〜6mol/L尿素溶液中，胶粒很快即行膨胀，以后再用规定的缓冲液充分洗去尿素。如凝胶水化不完全，装柱后还会继续膨胀，体积增加，这样会打乱层析规律，影响分离效果。为避免产生气泡，浸泡胶粒的液体体积不可过小，水化后的胶粒泡在水溶液中会因重力而下沉，用倾泻法反复洗3次〜4次即可用于装柱。在上清液中有时漂浮些细小的胶粒，这是由于凝胶颗粒大小不均匀，倾泻上清液时可以一并弃去。
凝胶柱的填装在凝胶层析中，层析柱大小的选择是依实验的要求而定的，一般采用圆柱形的玻璃柱或有机玻璃柱，在柱的底部常装有一层直径0.5mm的小玻璃珠，上面再铺一层细玻璃渣作为流床的支持体，也可选用一个烧结玻璃片或一个钻有一些小圆孔的玻璃片盖上滤纸片作为柱床支持体，不过烧结玻璃片作为床的支持物时，易为小的凝聚颗粒所堵塞，目前已加用一层尼龙网作为底部柱床支持体。
入口处和出口处的混合室必须愈小愈好，这样可以提高层析的灵敏度，如果下口的混合室较大，可以填充小玻璃珠或玻璃丝来弥补，柱顶部连接一长颈漏斗。装粗柱时漏斗颈的直径约为柱径的一半，通过橡皮塞与柱顶相接。装细柱时漏斗颈的直径可选用与柱径相近者，通过一合适的橡皮管将两者相接。漏斗与层析柱要保持垂直状态，可用一垂直的线锤来校正柱的垂直位置。在漏斗与层析柱中加满水或洗脱液，加液时必须注意将气泡赶净，使支持体筛板底部完全充满液体，然后将柱的下口紧闭，如果柱的底部支持体是钻孔的玻璃平面板时，可用一片比柱直径稍小而可以将筛孔盖住的快速滤纸圆片自柱顶加入，漂浮于水中，缓慢下沉，至平铺于柱底筛板上。
(1)填装W<7.5胶粒的柱子方法：胶粒水化制成悬浮胶液后要赶去气泡,在保持实验温度下填装柱子可以避免在实验过程中因受温度的影响使柱床收缩或膨胀。将胶混悬液调到适于倾泻的浓度再加入漏斗中，使胶粒逐渐扩散和下沉。当流床装至lcm〜2cm高以后，打开出液口，保持均匀不变的流速，直到装完为止。流速一般为每分钟5ml〜l0ml。当流床达到一定高度，平衡液已在胶床面上2cm〜5cm时关闭出液口。如果需要再加入胶粒，必须先在柱内胶床的顶部轻微搅拌，以使悬胶液均匀，在再加入胶粒之前若不搅拌，则会产生可见的二层胶带。产生这种情况时应该重装。柱填装完毕，在流床的上面盖上一个滤纸片，其大小要略小于柱的内径，这样可以防止样品中一些不溶物质混入流床，然后以洗脱液平衡柱子，直至流出液的离子强度或pH与洗脱液相同为止。一般只要流出液的体积超过流床体积，基本上就平衡好了。
各型Sephadex的较大承受压力(kPa)柱子垂直固定好后，下口接上一条细管，长度与柱长相近，照上法将柱内及漏斗充满平衡液，排除气泡，加入滤纸片，待滤纸片下沉至柱底后，从漏斗加入悬胶液，经20min后，将出口管拉到刚刚低于柱顶的高度，打开出液口，保持一定流速。如果填充胶床所需的凝胶开始时没有全部加到柱子里，在关闭排水口后可继续加入凝胶悬液，但必须使凝胶在柱内悬浮均匀。胶床水平面逐渐升起，没有出现胶带层表明填充是均匀的，再逐步放低柱的出口管，直至达到实验所需的操作压为止。不同型号的凝胶，耐压的能力不同，孔隙大的，若加压太大，胶粒易于变形，影响分离,减慢流速。各型凝胶的较大承受压力见表3-13-3。例如SephadexG-200最后操作压不能大于10cm，如果用一个泵加压，应注意压力不可过大，否则造成流速过快，流床改变。G-25以下的各型凝胶在平衡时，一般在流床上面加一个一定体积的贮液瓶(或分液漏斗），用胶管与柱上口封闭相接，这样就可以产生一定的静水压，即可以满足实验要求。
凝胶柱的检查为了保证凝胶过滤层析的分离效能，柱装好后检查装柱的质量是非常必要的。通常用一种有色物质的溶液(如铁蛋白液、印度墨水或带色的多糖溶液等)流过柱床以检査柱床的均匀程度，追随显色区带通过柱床的过程来判断填充的质量。若色带狭窄，均匀平整，说明柱的性能良好;如果色带歪曲，散乱变宽，则必须重新填装柱。
凝胶床的保养如凝胶床的保养得当，可以反复使用。胶床易为微生物腐蚀，必须防止，因为它不仅会影响凝胶的性能，同时也影响分离物质的性质。为了控制微生物的生长，磷酸离子和所有底物必须在凝胶床保存之前完全除去。进一步控制微生物生长的方法是将床真空保存或低温保存，但温度不可过低，介质的离子强度要高一些，以防冻结，影响凝胶结构。此外，常采用的方法是加入一些抗微生物生长的药剂。常用的药剂有:0.02%叠氮化钠，0.02%三氯丁醇，0.01%乙基汞硫代水杨酸，0.01%苯汞乙酸。方法是将胶床用水或平衡液洗净后，将药剂溶液过柱，然后再用水或平衡液将柱洗净。
(二）加样
为了避免流床的污染，并保持较高的流速，样品中不溶物必须去除干净。可以用过滤和离心的方法除去，因为如脂类化合物或脂蛋白等能够吸附在胶粒上，会给分离效果带来不良影响。至于分配等温线是线型的，凝胶过滤显然和样品浓度关系不大，但是，除了溶质的溶解度外，样品的粘度常常影响到浓度。样品的粘度不宜过大，若样品粘度大，将会形成较宽的带，可使分离效果减低，蛋白含量一般不能超过4%。样品的体积一般规定在凝胶床体积的1%〜4%，如初步分离可增加到10%，如为分离蛋白去盐，样品体积可扩大到凝胶床体积的20%〜30%。但样品体积过大，往往分离效果不理想。加样时将样品用移液管小心地移入柱的上端，待样品完全移入凝胶内，即加少量洗脱液。
另一种加样品的方法可以缩短加样时间，即在样品中加入适量蔗糖，调节其比重至较洗脱液为大，如此，不必吸去床上的液体即可直接用吸管加样了。
(三）洗脱
在上样之后，一般就可以开始洗脱了。将洗脱液装入一个下口瓶或分液漏斗中，以橡皮管与凝胶柱连接，连接处可用玻璃磨口，或橡皮塞闭封。完全不带电荷的物质可用蒸馏水洗脱，若物质有带电基因，洗脱液离子强度至少要大于0.02mol/L以获得较好的结果。因为Sephadex含有少量羧基，会吸附少量的阳离子而排斥少量的阴离子。大多数的物质从柱床洗脱时是借重力特性流动的，用低W胶粒，流体静压力影响流速甚小，可以适当的调节洗脱液的流速及洗脱液的高度即可。高W胶粒，须使用低的流体静压力，必须小心控制，以防止凝胶粒过紧。由于这种原因，要达到一个稳定的流速，应采用一种恒压洗脱装置。当样品粘度高，流速慢，或要求控制流速十分精确时，可在贮藏瓶上加一恒压供液泵。洗脱液可用人工或自动收集器按一定重量或体积收集。分部收集后的洗脱液的成分可根据其不同内容进行测定。例如核酸或蛋白质可直接通过紫外吸收光谱法，糖类、氨基酸等可以用显色反应测定，同位素标记的物质可以通过比放射性测定之。
(四）凝胶的再生
仅经过一个实验，胶床是不需要再生的。但在长时间使用后，流速会逐渐变慢，这主要是由于液流把胶床压紧的缘故。用水逆向洗涤或重新填装柱子，流速就可复原。流速降低有时也会是因灰尘之类沉积在胶床顶部所造成，如果每次实验结束后，把胶床顶部表面一层的凝胶去掉，再补充一些新的凝胶糊即可防止流速的变化。如果凝胶需要长时间保存时，还是以干燥成干胶粒后保存为宜。方法是先用水洗去游离的分子，如胶体积很大，可以用50%的乙醇洗，同时也可起到脱水作用。尽量洗去凝胶粒中的水分，再放在干燥器中抽干。接近干燥时，再加1倍〜2倍95%乙醇，搅开凝胶块，静置0.5h〜lh后再不时搅动，这样反复用乙醇处理4次〜5次，抽干后在烘箱中于6CTC〜8(TC下烘干，密封保存。凝胶脱水，切忌一开始就用浓乙醇处理，以防凝块。醇洗的浓度应逐渐加大。
(五）影响因素和注意事项
层析柱的准备凝胶层析的成功，在很大程度上决定于柱装的好坏。设计合适的层析柱有如下几点考虑:死体积(凝胶支持板到柱出口间的空间)要小；用细管连接流出液的形式要灵活、方便;凝胶床的支持板(常用尼龙筛板)不能被堵塞;还要注意保持床面的一些措施。
细玻璃球或用加热处理的玻璃筛板不能用作凝胶床的支持板，因为它们能吸附很多蛋白质。
根据具体情况，选择凝胶类型和柱的大小。用来从大分子(M.W>2000)中分离小分子，如无机盐或代谢中间物(M.W<1500)时，柱床体积应是上样体积的4倍〜10倍，柱高：柱直径应为5:1〜15:1,这类柱叫除盐柱。一般使用很小孔径的凝胶，其排阻极限在25000以下。相反，用来分离大分子时，柱床体积应为上样体积的25倍〜100倍，柱高与柱直径之比应为20:1〜100:1。
直径小(小于lcm)的柱，在湿润的玻璃柱壁上有“壁效应”，即降低靠近柱壁的溶剂的流动。这个效应是由于壁和沿壁流动的分子间的摩擦力引起的，能严重降低柱的分辨力。用二甲基二氯硅烷处理柱壁可以克服这个缺点。但这样处理所带来的弊病是可能降低柱的流速。
洗脱剂的离子强度和pH值非水溶性物质的分离，多采用Sephadex-LH，可以用一种有机溶剂来洗脱。对于水溶性物质的分离，按照被分离物质的性质，选用适宜的洗脱条件。离子强度和pH值一般对凝胶无多大影响，主要是考虑被分离物质解离、聚合、溶解度和稳定程度。离子强度的变化对物质分离具有不同的影响，例如洗脱碱性蛋白时，需要用含有一定浓度的盐的洗脱液洗脱，这样可以随盐浓度的增加而使移动加快，但是等电点低于pH7.0的一些蛋白质在分离洗脱时受离子强度的影响甚小。盐类洗脱剂也能控制Sephadex凝胶的吸附作用，硼酸盐溶液可以与凝胶发生吸附，不宜用此为洗脱剂。pH的影响和被分离物质的酸碱性质有关，碱性物质易被酸性溶液洗脱，酸性物质易被碱性溶液洗脱，多糖和核酸之类的物质用水或中性盐溶液洗脱即可。