蛇毒,细胞毒素的鉴定

最早观察到响尾蛇科及蝰科蛇伤病人的受伤肢体往往发生组织溶解,严重时仅留下骨头,这种溶组织的作用被认为主要是因蛇毒中含有细胞毒素的缘故。一些细胞毒素已经分离纯化,如从眼镜蛇毒中分离出两种细胞毒素,它们对吉田肉瘤细胞及腹水癌细胞不论体内或体外试验都有很强的细胞毒作用。细胞被扰乱的程度来判断毒素的毒性作用。

最早观察到响尾蛇科及蝰科蛇伤病人的受伤肢体往往发生组织溶解,严重时仅留下骨头,这种溶组织的作用被认为主要是因蛇毒中含有细胞毒素的缘故。

一些细胞毒素已经分离纯化,如从眼镜蛇毒中分离出两种细胞毒素,它们对吉田肉瘤细胞及腹水癌细胞不论体内或体外试验都有很强的细胞毒作用。细胞毒素也能直接溶解豚鼠、狗和猫的红细胞,所以它们和直接溶血因子也可能是同一类物质。细胞毒素还能使骨骼肌收缩、使离体蛙心停止于收缩期,因此又认为它也就是心脏毒素,但由于毒理鉴定工作中尚有未弄清的问题,还不能把两者看作同一物质。

细胞毒素能对多种细胞引起变性及溶解,其作用可能是由于它对膜受体起作用,导致膜结构改变释放出细胞内容物。测定某些细胞内酶的量就可以了解细胞毒素的毒性作用。肝素能降低细胞毒素对细胞的毒性作用,因为肝素是高分子酸性的粘多糖,而细胞毒素则是碱性多肽,可以使两者结合在一起而降低了细胞毒素对细胞膜受体的作用。

从眼镜蛇毒中纯化得到的细胞毒素P6能抑制Na+-K+-ATP酶活性,这种作用与其溶解细胞作用有线性关系。细胞毒素抑制了Na+-K+-ATP酶可使细胞内的K+、Na+含量失去平衡而导致细胞肿胀破裂。

鉴定细胞毒素最简便的实验是试管法观察。可选用腹水癌细胞或吉田肉瘤细胞,细胞毒素对这两种细胞的毒性都很大,很容易观察到细胞的溶解现象。

细胞毒素的溶胞作用可以完全被钙离子所抑制,所以在做溶胞试验时,必须排除钙离子的影响,所用的腹水癌细胞或吉田肉瘤细胞要用生理盐水洗涤5次〜6次,除尽红细胞,用双层纱布滤去结缔组织,再以新鲜的缺钙台罗Tyode液洗3次,最后再用台罗液稀释到大约5%(2X107个/ml)的乳白色悬浮液,于5"C保存,当天使用。所有反应液都应用缺15的台罗液配制,试验液在37°C保温一定时间后,取样在瓷板上与一.份Lissamine绿及一份肝素溶液(2mg/ml)混合,中止反应。在血细胞计数板上观察计数,以染色细胞与细胞总数之比代表破坏细胞的百分比。

(―)细胞毒性测定

方法一(Mclimans等的染料排除法,1975)

用0.7%的胰蛋白酶(Hanks液配)把细胞从培养瓶中取出,用Hanks液洗2次〜3次,然后把细胞的溶液调至3X105个/ml,取4.5ml细胞悬液加0.5ml细胞毒素,细胞毒素的浓度为l5f^g/ml〜90/xg/ml。每隔30min取出一定量的反应液与0.4%的苔酌蓝(Hanks液配)以9:1混合,lOmin后用血细胞计数法计算被染色和不被染色的细胞比例,并和未加细胞毒素的样品进行比较。在显微镜下被染色的细胞是死亡的细胞。

方法二

该方法是测定细胞毒素对红细胞的毒性,也可以用该法测定直接溶血因子(DLF)的活性。

以柠檬酸钠为抗凝剂(3.8%)收集家兔血,离心去掉血浆,用Hanks液洗2次〜3次,在一支试管中加0.6ml3%的红细胞悬液,再加细胞毒素,细胞毒素的终浓度为l5;xg/ml〜90pg/ml,最后用Hanks定容到5ml,反应液在37'C下保温2h,在540nm处测定光的吸收值。不加细胞毒素的样品为对照,红细胞全部发生溶血的OD54Dnm=l.0。

(二)毒素对培养细胞单层的扰乱作用测定

培养细胞前,在培养瓶中放几块盖玻片,当玻片被细胞覆盖之后取出。每个含有3mlHanks和毒素(15/xg/ml〜90/xg/ml)的培养瓶中放一块上述长满细胞的玻片,在37C下保温,用显微镜在不同时间观察玻片上细胞单层被破坏的情况,并进行显微照相。可以根据

细胞被扰乱的程度来判断毒素的毒性作用。

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